母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的检测方法及其试剂盒技术

一种母系遗传耳聋线粒体基因１５５５位Ａ→Ｇ突变的检测方法，其特征在于该方法使用Ｇｅｎｅｔｏｏｌ　Ｌｉｔｅ程序协助设计引物，通过ＰＣＲ扩增，在被测样本的ＰＣＲ扩增片段上产生定点突变，从而在该基因的１５５５位邻近引入一个包括１５５５位在内的新的限制性酶位点，然后用相应的限制性酶消化，检测该突变的存在。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体是涉及母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的检测方法。本专利技术还涉及制备根据该方法的体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，以及该试剂盒在检测所说的A→G突变中的应用。
技术介绍
氨基糖甙类抗生素(链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素及小诺霉素等)因其广谱高效的抗菌作用以及低廉的价格在临床上被广泛用于控制革兰氏阴性和阳性菌感染，但此类抗生素具有严重的耳毒性副作用，可使患者发生不可逆转的听力损失。近十年来研究发现，部分氨基糖甙类抗生素致聋患者有母系遗传家族史，并与线粒体DNA12SrRNA基因(以下简称为线粒体基因，或mtDNA)第1555位A→G均质性点突变有关(PrezantTR等，Nat Genet,1993，4289-294；袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，3367-70)。单次剂量的氨基糖甙类药物应用即可导致携带此突变个体的重度听力损失。根据目前己有的研究结果可知，几乎携带此突变的个体在应用不同剂量的氨基糖甙类抗生素后均发生严重或较严重的听力损失，是后天性获得性耳聋发生的重要原因。鉴于这一耳聋的有明确的基因变化和诱发因素，使得这种耳聋成为一种可以预防的疾病。在中国己报道的线粒体基因1555A→G(mtDNA1555A→G)突变母系遗传耳聋家系己超过50个，各家系发病人数从2-50人不等，考虑到尚有很多同类家系尚未被发现报道，以及此突变在散发性耳聋的致病机制中占有一定的比例，对这种耳聋的预防变得更为重要。其预防的关键环节在于通过筛查，检测发现携带mtDNA1555A→G突变的个体，绝对禁止此类个体接触氨基糖甙类抗生素，从而避免严重的耳毒性反应发生。自1993年以耒，对此突变的检测除了直接测序外，最常用的筛选方法为BsmA1(Alw261)酶切法(Fische1-Ghodsian等，AmJOtolaryngol，1993，14399-403；Fischel-Ghodsian等，AmJOtolaryngol，1997b，18173-178；袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，3367-70)。在国内外，普遍应用限制性酶BsmAI(Alw26I)酶切配合序列分析鉴定有无mtDNA1555A→G突变，酶切鉴定方便快捷，结果可靠，但不足的是BsmAI(Alw26I)价格较贵，与常用的限制性酶相比，价格差异达50-100倍，因此，迫切需要一种简单、快速、准确而且成本低的检测方法，以满足对mtDNA1555A→G突变进行广泛筛查的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前检测mtDNA1555A→G突变的方法所存在的缺点，提供一种简单、快速、成本低的检测母系遗传性耳聋mtDNA1555A→G突变的方法；本专利技术的另一个目的是提供检测母系遗传性耳聋mtDNA1555A→G突变的试剂盒；本专利技术还有一个目的是提供本专利技术的试剂盒在预防母系遗传性耳聋中的应用。本专利技术的目的通过下述的方案实现使用GenetoolLite程序(美国Biotools公司提供的软件)协助设计引物，通过PCR扩增，在被测样本的PCR扩增片段上产生定点突变，从而在该基因的1555位邻近引入一个包括1555位在内的新的限制性酶切位点，然后用相应的限制性酶消化，检测该突变的存在。其中所设计的引物中，正向引物是线粒体DNA的核苷酸1463-1482，其序列为序列表中的SEQIDNO1；反向引物是线粒体DNA的核苷酸1575-1556，其中1557位的A置换为C，其序列为序列表中的SEQIDNO2；引入的新的限制酶位点为HaeIII，其识别序列位于线粒体DNA的核苷酸1554-1557。本专利技术人还利用本专利技术的方法和设计的引物提供用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变，该试剂盒含有1.提取血样DNA的试剂；2.PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10XPCR缓冲液、Mg++、三蒸水、Taq酶；3.等比例混合的权利要求2所述的正向引物和反向引物；4.限制性酶HaeIII及其配套的缓冲液；5.阳性标本对照、阴性标本对照，以及6.使用说明书。在本专利技术的实施方案中，引物设计的指导思想是在1555位点邻近的2-4个碱基引入一个碱基替换，造成可能的能够鉴别mtDNA1555野生型(A)和突变型(G)的新的限制性酶切位点。使用GenetoolLite程序协助设计引物，设计原则为根据己知的线粒体基因的序列，使正向引物的3’末端位于1554位，反向引物在1555位的下游约120bp处，或使反向引物的3’末端位于1556位，正向引物在1555位的上游约120bp处，从而使PCR扩增后的产物包含1555位核苷酸(参照图1)；同时分别在1552、1553和1557、1558位引入可能的碱基置换，使形成的新的限制酶识别序列中包含1555位核苷酸，然后用enetoolLite程序检索出能鉴别线粒体基因1555野生型(A)和1555突变型(G)的新的限制性酶位点。应用GenetoolLite程序将1553、1552位点分别进行所有可能的碱基替换，未发现能够鉴别1555A→G突变型和野生型的新增限制性酶切位点；将1557、1558位点分别进行所有可能的碱基替换时，GenetoolLite程序发现将1557位点的A替换为C时，在mtDNA1555A→G突变型分子中造成限制性酶HaeIII的识别序列(GGCC)，其切点在1555和1556之间，而在mtDNA1555野生型分子中无此序列(其相应的序列为GACC)。由此设计出反向引物R1为nt1575-nt1556，其中3’端第二个碱基(1557)为异配碱基(T-G)；正向引物F1为nt1463-1482。F1R1扩增子长113bp。用以上设计的引物F1R1，以被测样本的DNA为模板，通过PCR扩增后能够获得明亮清晰的略大于100bp条带，证明反向引物3’端第二个碱基与模板异配并没有影响PCR的效率。F1R1PCR产物包含mtDNA1555位点，若模板为1555A→G突变型分子，则113bp的PCR产物存在HaeOII酶切位点，HaeOII酶切后获得93bp和20bp两个条带；若模板为mtDNA野生型分子，则113bp的PCR产物不存在HaeOII酶切位点，不能被HaeOII切开，酶切后仍是113bp一个条带。利用此区别，可以对1555A→G突变型分子进行简单、快速的测定。本专利技术者还根据本专利技术中设计的引物序列，通过人工合成(通过给定序列由自动化核酸合成仪合成)获得引物，并与提取血样DNA的试剂；PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10×PCR缓冲液、Mg++、三蒸水、Taq酶；限制性酶HaeOII及其配套的缓冲液；阳性标本对照、阴性标本对照，以及使用说明书组合起来，提供了用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，其主要功能在于将所有试剂集成在一个小盒内，使得DNA提取、核酸片段扩增、酶切鉴定可以在试剂盒提供的试剂基础上顺序完成。根据取血方式或被测样本形式的不同，本专利技术的试剂盒有三种类型可供选用，三种类型中除了提取血样DNA的试剂外，其余组分都相同。一型试剂盒的提取血样D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戴朴，袁慧军，李为民，曹菊阳，
申请(专利权)人：金政策，
类型：发明
国别省市：