一种制备核酸探针库的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备核酸探针库的方法，目的是提供一种廉价、批量制备核酸探针库的方法。本发明专利技术的技术方案是以在５’带有与克隆的探针序列、载体序列以及培养菌的基因序列无关的通用序列，３’带有探针扩增序列的寡核苷酸为引物，以含有探针克隆的培养菌或者质粒为模板进行扩增，得到一级探针库；然后以通用序列为引物，一级探针库为模板进行扩增，得到二级探针库；以此类推，以探针扩增序列为引物，以前面得到的探针库为模板进行扩增，获得核酸探针库。采用本发明专利技术的方法可以批量、廉价地制备微阵列探针库，所制备探针库利于保存，抗打击能力强，扩增条件易于控制，可以减少甚至消除非特异扩增，探针纯化较传统方式简单。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中制备微阵列探针库的方法，特别涉及制备核酸探针库的方法。
技术介绍
“生物芯片”的概念自上个世纪九十年代被提出后，生物芯片技术以其集成化、微型化、易于自动化等特点远远超越了许多传统的生物技术，并以其巨大的应用价值和市场潜力，吸引了世界范围的广泛兴趣，在短短的10年时间内获得了飞跃性的发展和完善，基于生物芯片的新技术、新方法层出不穷。目前，生物芯片已由最初的微阵列芯片，基因芯片发展出了许多纷繁复杂的门类，其中包括蛋白质芯片，抗体微阵列，神经元芯片，组织芯片，毛细管芯片以及芯片实验室等。在技术本身不断完善的同时，生物芯片的应用领域也在不断地拓宽，除传统的表达分析，突变检测之外，生物芯片在生命科学以及与生命科学相关的各个领域亦被广泛应用(Lockhart DJ，et al.NatBiotechnol 1996；141675-1680；Hacia JG，et al.Nat Genet 1996；14441-447；Wodicka L，et al.Nat Biotechnol 1997；151359-1367；Hacia JG.Nat Genet 1999；2142-47；Schena M，et al.Science 1995；270467-470)。发展得最为成熟、应用最为广泛的是用于表达谱变化分析的微阵列芯片。探针的制备是微阵列芯片中的一个关键技术环节。常规的表达谱芯片中的探针一般为双链PCR产物。这种形式探针的获得方式如下以探针克隆为模板进行PCR扩增，琼脂糖电泳检测扩增效果，纯化浓缩PCR产物，纯化的方式一般是试剂盒或者简单的乙醇沉淀(Hegde P，et al.Biotechniques 2000；29548-4，556.)，也可以不纯化，直接浓缩而用于点样(Diehl F，et al. Nucl Acids Res 2002；30e79.)。这种方式的缺点是以含有探针克隆的工程菌为起始，需要经常性的动用原始的克隆库，反复的冻融易导致克隆菌的死亡，而且在实际的操作中容易导致不同的克隆菌相互之间的交叉污染，克隆菌作为原始的保藏物，一旦死亡或者污染，会造成很大、甚至不可挽回的损失。另外克隆菌作为活的生物体，保藏条件较为苛刻，对环境变化的抗性较弱。在实际操作中，尤其是在对外提供服务时，需要对克隆进行反复测序以确保其准确性，增加了操作的复杂度和费用。为了克服传统生物芯片探针制备方式上的问题，有研究者用合成的70mer长的单链探针代替常规的PCR产物而作为探针(Fisher MA，et al.J Bacteriol2002；1844025-32.；Dudley AM，et al.Proc Natl Acad Sci USA 2002；997554-59.)。这种探针库的优点是序列明确，探针的浓度明确，且不同探针间的浓度一致，较容易保存，引入交叉污染的概率较小。合成的长的单链探针已经可以从专业公司获得(Qiagenoperon)。这种探针制备方式的缺点在于一次性购置成本高昂；另外，这种探针所采用的是明确的序列，只能用于分析已知基因，而不能够分析或者发现未知基因；再者，探针库本身不能够复制，一旦用完，需要重新购买。这种探针库在目前并没有得到广泛的应用，在已有的应用中，对于其效果的评价也是好坏参半。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种廉价、批量制备核酸探针库的方法。，是以在5’带有与克隆的探针序列、载体序列以及培养菌的基因序列无关的通用序列，3’带有探针扩增序列的寡核苷酸为引物，以含有探针克隆的培养菌或者质粒为模板进行扩增，得到一级探针库；然后以通用序列为引物，一级探针库为模板进行扩增，得到二级探针库；以此类推，以探针扩增序列为引物，以前面得到的探针库为模板进行扩增，获得核酸探针库。其中经常应用的是，得到二级探针库后，以探针扩增序列为引物，一级探针库或二级探针库为模板进行扩增，获得核酸探针库。在本专利技术的方法中，所述一级探针库制备时的通用序列以及探针扩增序列的引物在环境温度低于PCR扩增的退火温度时为发卡结构。所述发卡结构是在通用序列的5’端带有4到10个碱基长的序列，该序列与从3’端开始的与其等长的序列完全互补。为了使扩增的效果更好，所述通用序列与要扩增的探针库所对应的物种的基因序列、探针库所处的载体的序列以及载体所处的工程菌的序列不同源。在本专利技术的方法中，所述扩增的产物应经纯化、序列测定和稀释后待用。所述探针库制备时的稀释倍数一般为10到100,000倍。所述探针库制备时的纯化方式为凝胶回收纯化，高效液相色谱纯化或毛细管电泳纯化。所述探针库的保藏条件之一为冷冻干燥后置于室温避光保存或者-80℃至-20℃冷冻保存。保藏条件之二为溶于pH为6-8的去离子水或pH为7-9的TE缓冲液后置于-80℃至-20℃保存。本专利技术的原理及工作流程如图1、图2所示，图1中，a，模板；b，在室温下呈发卡结构的发卡引物；c，通用引物；d，常规引物；以在5’带有与克隆的探针序列、载体序列以及培养菌的基因序列无关的通用序列c，3’带有探针扩增序列d的寡核苷酸为引物，以含有探针克隆的菌培养或者质粒为模板a进行扩增，扩增的产物经纯化，序列测定和适当稀释后成为一级探针库。然后以通用序列为引物，一级探针库为模板进行扩增，扩增的产物经纯化和适当稀释后成为二级探针库。然后以探针扩增序列为引物，一级探针库或二级探针库为模板进行扩增，并依此类推获得制备表达谱芯片所需要的核酸探针。本专利技术方法综合了传统探针制备以及合成70mer探针的优点。通过严格的前期处理(高保真扩增，胶回收纯化及序列测定)后，可以得到与合成的70mer探针质量相当的PCR产物探针；探针库本身可以通过PCR产物而大量复制，因而极大地降低了对原始克隆库的依赖，同时大大的降低了库的成本。可以批量(1000～10,000倍于常规方式或者106～108倍于常规方式)、廉价地制作微阵列探针库，所制备的探针库以纯化的PCR核酸产物的稀释物形式存在，有利于保存，对意外情况的抗打击能力较强(例如冰箱临时断电)，不会发生象菌种死掉的情况。探针库是纯化的核酸，所以扩增条件比菌种和质粒更容易控制，基本不会有非特异扩增，用于点样的扩增产物的纯化也可以较现在的常规方式简单。因为可以抽干保存，输送起来极其方便。本专利技术的方法可以用于血液相关病毒快速检测芯片，进一步扩大后可以用于常规的表达谱芯片，对于大批量制备表达谱芯片和高通量药物筛选芯片的探针库具有重要意义。附图说明图1为本专利技术的原理图。图2为本专利技术的操作流程图。图3为制备人基因微阵列探针的电泳检测图谱。图4为制备感染性病原芯片探针的电泳检测图谱。具体实施例方式实施例1制备人类基因克隆探针库1、人类基因探针克隆从生物芯片北京国家工程研究中心的人类基因克隆库中随机挑选了三个不同长度的克隆175C1，175D3，175A5(生物芯片北京国家工程研究中心统一编号)，其所包含的人类基因克隆的长度分别为490bp，750bp和1000bp，从长度上基本覆盖全部的克隆。这些克隆将以两种不同的形式作为表达谱芯片探针制备的模板。第一种形式为保存的工程菌培养物，第二种形式为碱裂解法制备的质粒。2、引物常规引物上游引物5’CTG CAA GGC GAT 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备核酸探针库的方法，其特征在于：以在５’带有与克隆的探针序列、载体序列以及培养菌的基因序列无关的通用序列，３’带有探针扩增序列的寡核苷酸为引物，以含有探针克隆的培养菌或者质粒为模板进行扩增，得到一级探针库；然后以通用序列为引物，一级探针库为模板进行扩增，得到二级探针库；以此类推，以探针扩增序列为引物，以前面得到的探针库为模板进行扩增，获得核酸探针库。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陶生策，程京，马雪梅，
申请(专利权)人：清华大学，北京博奥生物芯片有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]