促进核酸转移的方法技术

本发明专利技术提供了一种将所需核酸有效转移至细胞中的手段。本发明专利技术包括使用包含胶原或其衍生物及所需核酸的复合物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药领域，特别是基因治疗和遗传学基础研究领域。更特别的是，本专利技术涉及促进所需核酸向靶细胞中转移的制剂及相应的方法。背景知识最近，人们积极地研究基因治疗，并将之实际应用于各种癌症和遗传性疾病的临床治疗。基因治疗是通过修补或纠正缺陷型基因来治疗疾病的一种方法，包括将编码一种目的酶、细胞因子或类似物质的基因转移到病人的细胞中，使得基因在体内产生目的物质，从而治疗疾病。基因治疗是一种控制生命基础的药物疗法，在治疗AIDS、类风湿关节炎、生活方式相关疾病以及癌症和遗传性疾病等各种疾病方面具有潜力。在基因治疗中，基因向靶细胞的转移效率是影响治疗效果增加的一个重要的因素。癌症的基因治疗包括通过腺病毒之类病毒的治疗(Cardiovascular Research，28，445(1994)；Science，256，808(1992)；Gastroenterology，106，1076(1994)；TIBTECH，11，182(1993)；J.Biol.Chem，266，3361(1991)；Nature Medicine，1，583(1995)和其中引用的参考文献)和通过脂质体制剂的治疗(Biochem Biophys Acta，1097，1(1991)；Human Gene Therapy，3，399(1992)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，11277(1992))。使用病毒载体治疗的基因转移效率通常比使用脂质体制剂治疗的基因转移效率要高。但是，使用病毒载体治疗存在一个问题，即机体对病毒的免疫应答使多次给药无法实施(J.Biol.Chem.，269，13695(1994)；Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，10，369(1994))。另一方面，由于全部人类遗传信息(人类基因组)的分析几乎已经完成，研究焦点已经转移到了如何将收集到的人类遗传信息用于医药和工业领域的后基因组策略上。尤其是使用分析过的遗传信息验证人类基因功能以及基因编码的蛋白质的结构和功能。这种后基因组验证需要表达并产生蛋白质，这一过程必然涉及到将所需基因向细胞的转移。使用腺病毒载体和脂质体载体或质粒DNA载体向宿主细胞中导入的基因并不整合到细胞的基因组中，而是瞬时表达的。这种载体不能实现基因的持续表达，而持续表达在基因治疗和基因功能分析中是重要的。
技术实现思路
因此，有效地将代表一个基因的核酸转移到靶细胞中、使该基因不整合到宿主细胞的染色体上而长时间表达的方法将提供极大的用途。本申请的专利技术人发现胶原具有意料不到的作用，并创造了将核酸有效导入靶细胞的一种方法。特别是，我们发现胶原和质粒DNA之类核酸的接触令人惊奇地形成一种复合物，这种复合物的形成促进核酸向细胞的转移和基因的长时间表达。日本专利申请(kokai)No.71542/1997介绍了包含一种基因的制剂，其中基因包含在由胶原之类生物相容性物质组成的载体中。但这种制剂是一种在活体内逐渐释放基因的缓释制剂。本专利技术以新发现的胶原或胶原衍生物用途为根据。更特别的是，本专利技术涉及到(1)促进核酸向靶细胞转移的制剂，其包含胶原或胶原衍生物；(2)促进核酸向靶细胞转移的制剂，其包含和所需核酸形成复合物的胶原或胶原衍生物。优选的是促进核酸转移的制剂，其中复合物以颗粒形式存在。更优选的是促进核酸转移的制剂，其中颗粒的长轴(major axis)为300nm至300μm，优选的是300nm至100μm，较优选的是300nm至50μm，更优选的是300nm至30μm；特别的是，促进核酸转移的制剂，其中所需核酸是质粒DNA，其中复合物中胶原分子或胶原衍生物分子的数目和质粒DNA核苷酸单体的数目的比例是1∶20至1∶质粒DNA核苷酸单体数，优选的是1∶50至1∶质粒DNA核苷酸单体数，较优选的是1∶50至1∶4000，更优选的是1∶50至1∶2000，进一步优选的是1∶50至1∶1000；或促进核酸转移的制剂，其中核酸是寡核苷酸，复合物中胶原分子或胶原衍生物分子的数目和寡核苷酸中核苷酸单体的数目的比例是1∶1至1∶200，优选的是1∶3至1∶150，较优选的是1∶20至1∶120，更优选的是1∶50至1∶120；(3)一种复合物颗粒，其包含胶原或胶原衍生物及所需核酸；(4)一种制备根据本专利技术的复合物颗粒的方法，包括在含有抑制胶原缔合体(association body)形成的试剂的溶液中，将胶原或胶原衍生物和靶核酸相混合；(5)一种医用器具，其表面包被有上述(3)中的复合物颗粒，或一种细胞培养器具，其表面包被有复合物颗粒；(6)一种将所需核酸转移至靶细胞中的方法，或提高靶细胞中所需核酸表达水平的方法，包括使用上述(3)中的复合物颗粒；(7)一种检验靶细胞中基因或蛋白质功能的方法，包括使用上述(3)中的复合物颗粒包被固体表面，所述复合物颗粒包含基因、编码蛋白质的基因或抑制基因或蛋白质在细胞中表达的核酸；在固体表面上培养靶细胞；测定靶细胞中的核酸表达水平，或基因或蛋白质表达水平，或细胞的增殖率或表型；和(8)一种筛选用于治疗疾病的核酸的方法，包括使用上述(3)中的复合物颗粒包被固体表面，所述复合物颗粒包含抑制疾病相关基因在细胞中表达的核酸候选物；在固体表面上培养呈现疾病状态的细胞；测定受各种核酸候选物所抑制的基因的表达水平，或细胞的增殖率或表型；以下的工作实施例说明本专利技术用于促进核酸转移的制剂提高了基因向靶细胞的转移效率，表现为体外细胞培养系统中核酸表达。仅使用质粒DNA时这种体外细胞培养系统观察不到基因表达。那些实施例进一步说明本专利技术用于促进核酸转移的制剂增加了细胞中核酸的稳定性，表现为与脂质体制剂相比，核酸表达持续的时间更长。根据本专利技术，我们发现胶原和核酸之间发生静电和/或物理相互作用，形成复合物。因此，我们认为导致细胞内核酸稳定性增加的复合物形成是工作实施例中观察到核酸持续表达的原因。这和胶原持续释放基因的机制相当不同，传统上认为后者机制是随着胶原的生物降解，包裹在胶原基质中的基因逐渐释放。附图简述附图说明图1是代替绘图的琼脂糖凝胶电泳照片，描述特定浓度质粒DNA和不同浓度端胶原(atelocollagen)之间的静电相互作用。图2是代替绘图的琼脂糖凝胶电泳照片，说明氯化钠对质粒DNA和端胶原之间静电相互作用的影响。图3是代替绘图的琼脂糖凝胶电泳照片，说明硫酸乙酰肝素对质粒DNA和端胶原之间静电相互作用的影响。图4是显微照片，显示了质粒DNA和各浓度端胶原之间复合物的一种形式。图5是显微照片，显示了质粒DNA和各浓度端胶原之间复合物在保存一周后的一种形式。图6是比较端胶原凝胶制剂、阳离子脂质体制剂和质粒DNA在PBS溶液中基因表达持续时间的图。图7是说明包含各浓度胶原的复合物和质粒DNA转移效率之间关系的图，其中质粒DNA转移效率是以逐滴加入方式转染七天后测定的。图8是说明包含各浓度胶原的复合物中以荧光强度表示的质粒DNA转移效率的图，其中质粒DNA转移效率是转染七天后测定的。图9是说明包含各浓度胶原的复合物和质粒DNA转移效率之间关系的图，其中质粒DNA转移效率是以固相包被的方式转染七天后测定的。图10是说明包含各浓度质粒DNA的复合物和质粒DNA转本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于促进核酸向靶细胞中转移的制剂，其包含胶原或胶原衍生物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：寺田雅昭，落谷孝广，阿苏雄，本间纪美，佐野明彦，永原俊治，
申请(专利权)人：大日本住友制药株式会社，株式会社高研，
类型：发明
国别省市：JP[日本]