用于分析核酸混合物的探针、文库和试剂盒及其构建方法技术

本发明专利技术涉及用于检测、分类或定量复杂的核酸混合物，例如转录物组中的成分的核酸探针、核酸探针文库和试剂盒、以及它们的使用方法。本发明专利技术还涉及鉴定可用于该探针文库的核酸探针的方法和鉴定可用于检测给定核酸的手段的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于检测、分类或定量复杂的核酸混合物，例如转录物组(transcriptome)中的成分的核酸探针、核酸探针文库和试剂盒，以及它们的使用方法。
技术介绍
随着用于描绘成千上万基因的表达谱的微阵列，例如GeneChipTM阵列(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)的出现，利用传统方法例如Northern分析和点印迹分析所需的财力和物力的一小部分，就可以鉴定出表达的基因和细胞表型之间的相关性。微阵列允许开发多个平行试验以鉴定和验证疾病的生物学标记和可以用于诊断和治疗的药物靶标。此外，基因表达谱也可以用于评估和预测暴露于某种因子(例如，药物、潜在的毒素或致癌物等)或情况(例如，温度、pH等)的代谢和毒理学后果。微阵列实验常常产生仅其中一小部分对于实验者是有价值的冗余数据。此外，由于基于微阵列的分析的高度平行模式，对于各个捕获探针而言，条件可能不是最佳的。基于这些原因，微阵列实验十分经常地尾随使用单基因均相试验的验证研究或被该验证研究随后替代。这些单基因均相试验经常是基于定量PCR的方法，例如5′核酸酶试验或其它类型的双标记探针定量实验。然而，这些实验仍是耗时的单反应实验，受到高成本和耗时的探针设计程序的阻碍。而且，5′核酸酶试验的探针相对较大(例如，15-30个核苷酸)。因此，目前已知的均相试验系统中的这些限制性对微阵列发现结果的验证以及对聚焦的靶验证方法均构成了瓶颈。用于避免此瓶颈的一个方法是省去5′核酸酶试验中使用的昂贵双标记指示探针和分子信标，代之使用在结合双链而非单链DNA时发荧光的非序列特异性DNA嵌入染料，例如SYBR Green。使用该染料，可以无任何例外地实时检测任何扩增的序列。然而，该技术受到几个问题的阻碍。例如，PCR扩增过程中的非特异引物引发可以产生参与定量过程的与目的无关的非靶扩增子。而且，在该反应中普遍存在PCR引物之间的相互作用，从而形成“引物二聚体”。由于PCR反应中典型使用高浓度的引物，这可以导致显著数量的短双链非靶扩增子，该扩增子也结合嵌合染料。因此，通过实时PCR定量mRNA的优选方法是使用序列特异性检测探针。用于避免随机扩增和引物二聚体形成问题的一个方法是使用可以用于检测大量不同类型的核酸分子但又保持一定的序列特异性的通用检测探针，该方法已经由Simeonov等(Nucleic Acid Research30(17)91，2002；美国专利公布20020197630)描述，其涉及使用包含了具有给定的某个(或某些)长度的所有可能序列中10％以上的序列的探针文库。该文库可以包括各种非天然核酸碱基和其它修饰以稳定文库中探针/引物与靶序列的结合。即使如此，对于大多数序列，也需要至少8个碱基的最短长度来获得可以与大多数和应用(例如实时PCR)相关的试验条件相容的稳定程度。由于具有所有可能的8聚体(8-mer)的通用文库将含有65,536个不同序列，因此先前由Simeonov等考虑的甚至最小的文库也含有所有可能性的10％以上，即，至少6554个序列，这在操作上是不实际的而且其构建成本巨大。从实践的角度出发，几个因素限制了当前的均相试验应用的方便性和利用度。常规试验技术的使用者面临的问题包括.由于购买针对每个转录物的探针的价格很高，当尝试在少数样本中检测许多不同基因时，将会价格高得惊人。.合成标记探针是耗时的，而且从订货到收到厂家发出的货物的时间常常超过1周。.用户设计的试剂盒可能不会在第一次时起作用，因此，按每试验计，有效的试剂盒是昂贵的。.难于快速地检测新靶标或反复地改进探针设计。.商业有效探针的确切探针序列可能不为消费者所知，从而导致在结果的评估和科学出版的适宜性上出现问题。.当试验条件或成分不清时，可能不能从替代来源定购试剂。本专利技术解决了这些实际问题并旨在确保快速和价廉地开发出用于定量基因转录物的准确而特异的试验。专利技术简述期望能够使用有限数量的寡核苷酸检测探针在均相试验系统中定量例如人类转录物组(transcriptome)中的大多数基因(例如，＞98％)的表达。本专利技术通过提供构建如下通用多探针的方法解决了当前方法在均相试验方面面临的上述问题，其中所述通用多探针(genericmulti-probes)具有足够的序列特异性以致它们不可能检测随机扩增的序列片段或引物二聚体，但各自仍能够检测许多不同的靶序列。这些探针可以用于不同的试验中，并可以组合在小探针文库(50至500个探针)中，当与靶特异性引物组联合时其可以用于检测和/或定量由成千上万个不同核酸组成的复杂混合物中的各成分(例如在由＞30,000个不同核酸组成的人类转录物组中检测各转录物)。每一个多探针(multi-probe)包含两个元件1)由一个或多个标记物组成以检测探针和靶的结合的检测元件或检测部分；和2)确保与目的特异靶(一个或多个)结合的识别元件或识别序列标签。检测元件可以是均相试验中使用的任何检测原理。可以通过与靶结合后一个或多个标记物的可测量的性质改变直接地检测结合(例如，有或没有茎结构的分子信标类试验)，或者可以通过结合后的随后反应(例如在5′核酸酶试验中通过DNA聚合酶的5′核酸酶活性进行的切割)来间接地检测结合。识别元件是新的本专利技术成分。它包含序列经选择以致能够检测给定的复杂样品混合物中一个大的靶核苷酸子集(subset)的短寡核苷酸部分。分别被设计用于检测许多不同靶分子的这些新探针被称作多探针。通过选择最频繁遇到的序列和利用短识别序列的重现来设计用于多个靶的探针的概念是新的，并与设计出来以便尽可能具有针对单个靶序列的特异性的常规探针不同。随后，周围引物和选择的探针序列相组合将确保该多探针的特异性。由试图用最少量的探针处理最大量的靶而产生的此新的设计原理同样是本专利技术的一部分。这通过如下发现得以实现非常短的8-9聚体LNA mix-mer探针与基于PCR的试验是相容的。在本专利技术的一个方面，在识别元件中掺入核酸碱基、核苷碱基或核苷酸的修饰物或类似物，以及可能地小沟结合剂及其它修饰，所有这些均旨在稳定探针和靶分子之间形成的双螺旋，以便可以使用最短的可能探针序列与最宽的靶范围。在本专利技术的一个优选方面，所述修饰是掺入LNA残基以将识别元件的长度减少至8或9个核苷酸并同时保持所形成的双螺旋的足够稳定性以便可以在通常试验条件下进行检测。优选地，修饰多探针，以使该探针与具有相同序列但无修饰的探针相比在相同检测条件，例如PCR条件或严紧杂交条件下对靶序列的结合亲和力增加至少两倍。优选的修饰包括，但不限于，包含已经通过化学部分修饰或已经被类似物(例如，包括核糖或脱氧核糖类似物)替代或者已经通过使用非磷酸二酯键的核苷酸间键(例如非磷酸酯的核苷酸间键)进行过修饰的核酸碱基、核苷碱基或核苷酸，以增加结合亲和力。优选的修饰还可以包括附着双螺旋稳定剂，例如小沟结合剂(MGB)或嵌入核酸(INA)。此外，优选的修饰还可以包括添加不管靶链相对位置上的核酸碱基如何均能够稳定双螺旋形成的无区分性碱基，例如5-硝基吲哚。最后，能够序列特异地与靶序列结合的、由非糖-磷酸主链组成的多探针，例如PNA，也是所考虑的修饰。所有上述增加结合亲和力的不同修饰在下文中将称作“稳定化修饰”(stabil本文档来自技高网...

【技术保护点】
寡核苷酸探针文库，其中文库中的每一个探针均由识别序列标签和检测部分组成，其中，在每一个寡核苷酸探针中至少一个单体是修饰的单体类似物，从而相对于相应的未修饰寡脱氧核苷酸而言增加了对互补靶序列的结合亲和力，由此这些文库探针具有足够的稳定性可以用于序列特异性地结合和检测任何给定靶群体中的靶核酸的实质性部分，并且，其中，不同识别序列的数目占具有给定长度的所有可能序列标签的不到１０％。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：NB拉姆辛，P莫里特曾，SM埃赫沃尔德，N托尔斯特鲁普，
申请(专利权)人：埃克斯魁恩公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]