一种用于研究鱼类遗传关系的DNA分子标记方法技术

本发明专利技术涉及鱼类的ＤＮＡ分子标记技术。本发明专利技术选择Ｓｏｘ基因族的ＨＭＧ（Ｈｉｇｈ　　ｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐ）保守区域为分子克隆的目标，设计独特简并引物，应用ＰＣＲ、琼脂糖凝胶电泳等方法获得在数目和种类上有差异的Ｓｏｘ基因的ＤＮＡ片段，用这些特殊的ＤＮＡ分子来判断和分析不同鱼类的遗传特性和遗传关系。该方法可以快速准确分析鱼类的遗传关系，也能应用于其他动物的遗传关系分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用分子遗传标记来分析鱼类之间的分子遗传关系，具体涉及用DNA分子标记来判断和分析不同鱼类的遗传特性和遗传关系。
技术介绍
对生物遗传变异的分析，一是直接测序，一是借助分子遗传标记。目前大规模全基因组测序发展迅猛，但对生物界所有物种测序是不现实的。分子遗传标记仍然是个体水平和群体水平上分析生物遗传多样性及其变化规律的主要手段，广泛应用于群体遗传学、系统学、进化生物学、遗传作图等理论研究及保护生物学、动植物遗传育种、疾病诊断等实践领域。目前，DNA分子标记主要有以下五种(1)线粒体DNA(mtDNA)分子标记；(2)基于Southern杂交分子标记，如限制性片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)，荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)和单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)；(3)基于PCR的分子标记技术，如随机扩增多态性DNA(Random Amplification Polymorphic DNA，RAPD)，扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)和单链构象多态-DNA聚合酶链式反应(Single-Strand ConformationPolymorphism-Polymerase Chain Reaction，SSCP-PCR)；(4)基于重复序列的分子标记，如微卫星DNA和小卫星DNA；(5)基于mRNA的分子标记，如逆转录PCR(Polymerase ChainReaction)和差异显示逆转录PCR。1990年，Sinclair等人在人类和小鼠中克隆了睾丸决定因子SRY/Sry(Sexdetermining region on Y chromosome)基因，进一步研究发现Sry基因编码的蛋白质产物中含有一段具有高度保守性且具有结合DNA功能的区域(称为high mobility group，HMG)。Sox基因族编码的蛋白质中都含有HMG区域，每个Sox基因的HMG序列与Sry基因的HMG序列至少具有60％的同源性。目前，已在进化位置明显不同的各类物种如哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类以及昆虫中克隆出了40多个Sox基因，对其序列和功能进行了研究，迄今发现的所有Sox基因，按其HMG-box盒的同源性程度，可划分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10个不同的亚族。如C组的Sox4基因参与心脏管腔发育，E组的Sox9基因参与睾丸的发育，F组中的Sox18基因参与血管的发育。但是目前还没有利用Sox基因族的DNA片段作为分子遗传标记来判断不同鱼类的遗传特性和分析它们的遗传关系的报道。
技术实现思路
本专利技术旨在应用扩增获得的DNA片段作为分子遗传标记分析不同鱼类之间的遗传关系。本专利技术是通过以下技术方案实现上述专利技术目的的用Sox基因族的HMG-box的保守序列设计简并引物，通过PCR、琼脂糖凝胶电泳获得Sox基因的DNA片段，根据扩增片段在数目和种类上的共同性和差异性分析不同鱼类之间的遗传关系，简并引物序列为上游引物5’TGAAGCGACCCATGAAC/TG 3’；下游引物5’AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT 3’。下面结合附图进一步详述本专利技术。附图说明图1部分鱼种Sox基因HMG-box DNA片段的扩增图。其中M200bp分子梯度标记；1.红鲫；2.鲤鱼；3.鲫鲤F1；4.鲫鲤F2；5.异源四倍体鲫鲤；6.雄核发育二倍体鲫鲤；7.雌核发育二倍体鲫鲤第一代(G1)；8.雌核发育二倍体鲫鲤第一代(G2)；9.日本白鲫；10.雌核发育日本白鲫；11.三倍体湘云鲫(日本白鲫(♀)×四倍体鲫鲤(♂))；12.三倍体鲫鱼(红色双尾金鱼(♀)×四倍体鲫鲤(♂))；13.异源四倍体鲫鲤；14.红色双尾金鱼；15珍珠双尾金鱼；16.黑色双尾墨龙金鱼；17.本地鲫鱼；18.彭泽鲫。图2部分鱼种Sox基因HMG-box DNA片段的扩增图。其中M200bp分子梯度标记1.雌核发育二倍体鲫鲤；2.异源四倍体鲫鲤；3.雌核发育二倍体鲫鲤(G1)(♀)×四倍体鲫鲤(4n)(♂)；4.单尾红鲫；5.双尾红鲫；6.灰色鲤鱼；7.白色鲫鱼。引物设计参照不同物种中Sox基因HMG保守区序列，用Primer Premier 5.0软件和Jellyfish1.4软件设计独特的简并引物，由上海Sangon公司合成。其序列如下上游引物5’TGAAGCGACCCATGAAC/TG3’；下游引物5’AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT3’。实验材料红鲫(Carassius carassius red var.，2n＝100)和鲤鱼(Cyprinus carpio L.，2n＝100)及其二倍体杂交后代鲫鲤F1-F2，异源四倍体鲫鲤(人工鲫鲤杂交产生的四倍体鱼)，雄核发育二倍体鲫鲤，雌核发育二倍体鲫鲤第一代(G1)、第二代(G2)，日本白鲫(Carassius auratus cuvieri)，雌核发育日本白鲫，三倍体湘云鲫(日本白鲫(♀)×四倍体鲫鲤(♂))，三倍体金鱼(红色双尾金鱼(♀)×四倍体鲫鲤(♂))，黑色双尾墨龙金鱼，珍珠双尾金鱼，红色双尾金鱼，雌核发育二倍体鲫鲤第一代G1(♀)×异源四倍体鲫鲤4n(♂)自交后代分离出的单尾红鲫，双尾红鲫，灰色鲤鱼，白色鲫鱼，本地鲫鱼，彭泽鲫(Carassius auratus varpengze)。基因组DNA的提取血液DNA的提取按照上海Sangon的UNIQ-10柱式基因组DNA提取试剂盒进行。提取的DNA用紫外分光光度计检测其浓度，-20℃保存。PCR扩增和克隆PCR反应在美国Applied Biosystems公司生产的GeneAmpPCR System 2700热循环仪上进行，每个扩增反应总体积为25μl，其中模板基因组DNA 80ng，每种dNTP200μmol.l-1，每种引物各0.25μmol.l-1，TaqDNA聚合酶1.25U，反应液在94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸80s，共35个循环，最后在72℃延伸10min。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳中分离，用上海Sangon公司胶回收试剂盒纯化切取的扩增片段，纯化方法参照产品手册进行。将回收的DNA片段克隆于载体pMD18-T(TakaRa公司)，连接反应及细菌转化按pMD18-T载体试剂盒说明书进行操作。测序和序列分析选取阳性克隆菌落，提取重组质粒pMD18-T，经过菌落PCR和酶切鉴定后，由上海Sangon公司对阳性克隆进行测序，采用Blast软件进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较，根据其与查询序列的最高相似性而命名所得克隆。本研究根据Sox基因家族HMG保守区设计独特简并引物，通过PCR扩增不同鱼类基因组DNA片段并对一些DNA片段的序列进行了测序。结果表明，不同鱼类中Sox基因的DNA片段扩增产物在数目、大小和种类方面存在共同性和差异性，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用以分析鱼类遗传特性和遗传关系的ＤＮＡ分子标记方法，其特征在于用Ｓｏｘ基因族的ＨＭＧ－ｂｏｘ的保守序列设计简并引物，通过ＰＣＲ、琼脂糖凝胶电泳获得Ｓｏｘ基因的ＤＮＡ片段，根据扩增片段在数目和种类上的共同性和差异性分析不同鱼类之间的遗传关系，简并引物序列为：上游引物：５’ＴＧＡＡＧＣＧＡＣＣＣＡＴＧＡＡＣ／ＴＧ３’；下游引物：５’ＡＧＧＴＣＧ（Ａ／Ｇ）ＴＡＣＴＴ（Ａ／Ｇ）ＴＡ（Ａ／Ｇ）ＴＴ３’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘少军，刘筠，刘季芳，李伟，陶敏，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]