本发明专利技术公开了一种黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法，包括黄颡鱼ＸＹ性染色体特异ＡＦＬＰ标记的筛选和克隆，黄颡鱼ＸＹ性染色体特异ＳＣＡＲ标记的设计，黄颡鱼性染色体基因型（ＸＸ／ＸＹ／ＹＹ）ＰＣＲ鉴定方法的建立。本发明专利技术建立了黄颡鱼性染色体特异ＡＦＬＰ标记筛选方法，从２５６个ＡＦＬＰ引物组合中筛选到３个引物组合能够产生４个Ｘ或Ｙ染色体特异ＡＦＬＰ片段，创建了黄颡鱼性染色体基因型ＰＣＲ鉴定方法。本发明专利技术首次筛选到黄颡鱼Ｘ和Ｙ染色体特异分子标记，建立了黄颡鱼遗传性别鉴定方法，并将本方法应用到全雄黄颡鱼培育过程中的遗传性别鉴定。本发明专利技术具有高效，准确和稳定的特点，在黄颡鱼性别控制和全雄黄颡鱼苗种的持续规模化生产中具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产生物
中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术， 更具体涉及一种。本专利技术 在黄颡鱼的性别控制和全雄苗种的培育中具有重要的应用价值，同时在其它 鱼类性别控制和单性苗种生产中也具有应用前景。
技术介绍
一黄颡鱼是具有较高经济 价值的底栖鯰形目鳍科鱼类，广泛分布于江河、湖泊、水库等水域。其肉质 鲜美，营养丰富，肌间刺少，因而深受消费者青睐。近年来价格较高，市场 需求量日益增大。黄颡鱼雄鱼比雌鱼生长快。据调査，在相同养殖条件下， 第一年雄性黄颡鱼比同胞雌鱼的生长速度快30%左右。在养殖的第二年，其 雄鱼生长至150-200克，而雌鱼却只有50-75克，雌雄生长差异接近3 倍。因此，如果能够在育种中人工控制黄颡鱼的性别，培育出全雄黄颡鱼， 将大大提高产量，降低养鱼成本，提高经济效益。生产单性雄鱼有几种方法可供选择如人工挑选、雄性激素直接诱导性 逆转、雄核发育、种间杂交、人工诱导三倍体以及遗传学方法等。目前，使 用遗传学的方法生产XY全雄鱼在尼罗罗非鱼单性养殖使用过。这种称为 GMT技术，适用于雄性配子异型的鱼类，方法可靠、稳定，而且对环境友 好，无不良的影响。最近刘汉勤等成功地从XY生理雌鱼雌核发育产生了 YY超雄鱼，并且通 过与XX雌鱼测交得到了全雄子代，验证了YY超雄鱼的存在，说明了该技术 路线的可行性，也为全雄黄颡鱼的生产打下了坚实的基础。但当应用到大规 模生产中时，该技术存在一些技术瓶颈，阻碍了全雄鱼的生产，比如生产 实践中发现，通过黄颡鱼XY雌鱼雌核发育产生YY超雄鱼的同时，也产生了 XY正常雄鱼，其数量与YY超雄鱼不相上下，阻碍了 YY超雄鱼在全雄鱼苗 培育中的应用。因此如何准确快捷地鉴定开YY和XY雄鱼成为实现全雄黄颡 鱼苗规模化生产中的一个关键点。传统的方法只有通过测交实验后，根据子 代性别比例，才能判断出其父本为遗传YY或XY雄鱼；而在测交实验中，测 交子代需要养殖3个月以上才能解剖根据组织学判断其性别，因此实验周期 长，养殖成本高，不利于大规模生产；不仅如此，多年来的繁殖实验，还未 发现YY超雄鱼具有和正常XY雄鱼一样的自然繁殖能力；而且黄颡鱼精巢为 小叶型，在行人工繁殖时几乎是无法挤出精液的，因此测交实验时，通常要 杀掉雄鱼从精巢获得精液进行人工授精。因此无法通过测交实验直接获得活 的YY超雄鱼用于持续生产全雄鱼苗。综上所述，要实现全雄黄颡鱼苗的规模化生产，急需一种经济、快捷、 准确且不须杀害黄颡鱼的YY超雄鱼鉴定方法。随着DNA分子标记技术的发展和成熟，利用DNA标记鉴定性别成为可 能，为我们提供一种经济简捷并且准确的遗传性别鉴定手段，但前提是要先 筛选到性别特异DNA标记。目前，在一些经济鱼类中，通过各种DNA分子标 记技术(RAPDs， RFLPs， SSRs， AFLPs等)筛选性别特异标记已有许多报 道，如Kovacs等利用RAPD扫描非洲鲶鱼(Clarias gariepinus) 雌、 雄基因池，找到两个雄性性别相关的RAPD标记；Sakamoto等发现两个SSR 标记(0royFGT19 TUF和0myRGT28 TUF )与雄性虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的性别决定位点相连锁。同时，鱼类的性别特异DNA标记通常具 有物种或者品系特异性， 一种鱼类的性别特异标记通常不能跨物种使用，因 此要利用分子标记实现黄颡鱼的遗传性别鉴定，首先要筛选到黄颡鱼的性别 特异标记。AFLP分子标记技术是一种基于PCR技术的多位点分子标记技术，具有 显示出很强多态性的能力。每对AFLP选择性扩增引物能够获得50-100个条 带，通过有限的引物组合可以获得大量的扩增片段。因此AFLP分子标记特 别适于对尚无分子遗传信息背景的物种进行研究。近五年来AFLP分子标记 技术在筛选性别标记研究中得到了较广泛应用，并且有一些成功的报道，如 Ezaz等用AFLP技术扫描尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus L.) 基因 组，找到3个Y染色体连锁(0niY425. 0niY382. 0niY227) 和一个X染色 体连锁(0niX420) 的AFLP标记；Brunelli等应用AFLP也找到了一个新 的大鳞大麻哈鱼Y染色体特异的标记。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传 性别鉴定方法，方法简单，操作方便，结合传统的YY超雄鱼培育路线，可 以实现全雄黄颡鱼鱼苗的规模化生产，进而为黄颡鱼养殖业提供全雄鱼苗， 最终达到提高黄颡鱼的产量，降低养鱼的成本，提高了经济效益的目的。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施如上所述，要实现全雄黄颡鱼的大规模生产，其关键点在于急需一种经济、快捷、准确且不须杀害黄颡鱼的YY超雄鱼鉴定方法。因此，本专利技术通 过筛选获得黄颡鱼性染色体特异DNA标记，并利用该标记实现快捷准确地鉴 定黄颡鱼的遗传性别，通过鉴定获得大YY超雄鱼用于全雄黄颡鱼苗的生产。本专利技术的基本构思是首先，采用AFLP分子标记技术，筛选获得黄颡 鱼X和Y染色体特异AFLP标记，转化成简捷使用的SCAR标记后，建立黄颡 鱼性染色体基因型(XX/XY/YY) PCR鉴定方法;其次，将本方法应用到全雄 黄颡鱼培育中的遗传性别鉴定，为全雄黄颡鱼苗的生产提供可靠的YY超雄 鱼。本专利技术的方法是采用AFLP分子标记技术筛选黄颡鱼X和Y性染色体 特异AFLP标记，克隆这些X或Y性染色体特异AFLP标记并序列分析，通过 染色体步移克隆这些特异标记DNA片段的侧翼DNA序列，通过序列分析比 对，选择适合设计引物的性染色体特异位点，设计特异引物，将这些标记转 化为方便使甩的SCAR标记，结合X和Y染色体特异SCAR标记，建立黄颡鱼 性染色体基因型(XX/XY/YY) PCR鉴定方法，将本方法应用到全雄黄颡鱼培育中各种繁殖组合的遗传性别鉴定，最终鉴定出YY超雄鱼用于全雄黄颡鱼 的生产。因此，本专利技术包括四大步骤一)筛选和克隆黄颡鱼XY性染色体特异AFLP标记；二)转化为XY性染色体特异SACR标记；三)建立黄颡鱼性染 色体基因型PCR鉴定方法；四)在全雄黄颡鱼培育中进行遗传性别鉴定。上述的一)筛选和克隆黄颡鱼XY性染色体特异AFLP标记包括-1. XY性染色体特异的AFLP标记筛选；2.性染色体特异AFLP标记的克 隆与序列分析；其中上述的1. XY性染色体特异的AFLP标记的筛选-按照常规方法从黄颡鱼M雌鱼、XY雄鱼和YY超雄鱼尾鳍样品中提取 基因组DNA，通过琼脂糖电泳及分管光度计来检测DNA的浓度，最终将DNA 浓度稀释成30ng/ii 1。AFLP筛选包括以下步骤1)使用商业上获得的和限制性 内切酶(NEB公司)对DNA模板进行酶切，2)使用商业上获得的T4 DNA连 接酶(NEB公司)，将特异接头连接到酶切片段两端，3)进行预扩增，4) 进行选择性扩增，5)电泳分析。使用商业上获得的&。 DNA聚合酶进行选择性扩增，采用上海生物工程 公司合成的AFLP引物(16个仏el序列引物分别与16个&oRI序列引物进 行组合，共256个引物组合)，对黄颡鱼8个XX雌鱼，8个XY雄鱼和8个 YY超雄鱼个体的基因组进行AFLP扩增分析。其本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法，它包括以下步骤： Ａ．筛选和克隆黄颡鱼ＸＹ性染色体特异ＡＦＬＰ标记，首先是ＸＹ性染色体特异的ＡＦＬＰ标记筛选，从黄颡鱼ＸＸ雌鱼、ＸＹ雄鱼和ＹＹ超雄鱼尾鳍样品中提取基因组ＤＮＡ，通过琼脂 糖电泳及分管光度计来检测ＤＮＡ的浓度，最终将ＤＮＡ浓度稀释成３０ｎｇ／μｌ，ＡＦＬＰ筛选包括以下步骤：１）使用ＭｓｅＩ和ＥｃｏＲＩ限制性内切酶对ＤＮＡ模板进行酶切；２）使用Ｔ４ＤＮＡ连接酶，将特异接头连接到酶切片段两端；３）进行预扩增；４）进行选择性扩增；５）电泳分析；使用２５６个引物组合进行ＡＦＬＰ选择性扩增，其中３个引物组合扩增出２个Ｘ染色体特异ＡＦＬＰ片段和２个Ｙ染色体特异ＡＦＬＰ片段，为：编号６２引物组合，序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１的上游引物Ｅ６和序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２的下游引物Ｍ２，在所有ＸＹ和ＹＹ个体中均扩增出一个大小为２３３ｂｐ的特异片段，同时编号３３引物组合，序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３的上游引物Ｅ３和序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４的下游引物Ｍ３，在所有ＸＹ和ＹＹ个体中均扩 增出一个大小为２２６ｂｐ的特异片段，这两个特异片段在所有ＸＸ个体的扩增产物中不出现，将这类只在所有ＸＹ和ＹＹ个体中出现，在ＸＸ个体中不出现的片段作为Ｙ染色体特异ＡＦＬＰ片段；另外，编号６２引物组合，在所有ＸＸ和ＸＹ个体中均扩增出一个大小为２３９ｂｐ的特异片段，同时６３号引物组合，序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１的上游引物Ｅ６和序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４的下游引物Ｍ２，在所有ＸＸ和ＸＹ个体中均扩增出一个大小为２２６ｂｐ的特异片段，这两个片段在所有ＹＹ个体中不出现，将这类只 在所有ＸＸ和ＸＹ个体中出现，在ＹＹ个体中不出现的片段作为Ｘ染色体特异ＡＦＬＰ片段；其次是性染色体特异ＡＦＬＰ标记的克隆与序列分析，其步骤是：１）黄颡鱼ＸＹ性染色体特异ＡＦＬＰ片段的回收；２）性染色体特异ＡＦＬＰ片段的克隆；３）性染色体特异ＡＦＬＰ片段的序列分析；克隆了黄颡鱼Ｘ染色体特异ＡＦＬＰ片段和Ｙ染色体特异ＡＦＬＰ片段，分别命名为Ｐｆ－Ｙ６２、Ｐｆ－Ｙ３３、Ｐｆ－Ｘ６２和Ｐｆ－Ｘ６３，其序列分别为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ．７和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８所示的核苷酸序列；序列分析显示：性染色体特异ＡＦＬＰ片段Ｐｆ－Ｘ６２和Ｐｆ－Ｙ６２为黄颡鱼Ｘ和Ｙ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：桂建芳，王达，毛慧玲，陈宏溪，刘汉勤，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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