一种快速检测转基因玉米BT11的方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因玉米ＢＴ１１的快速检测方法。其原理是采用４条特异引物及一种具有链置换活性的ＤＮＡ聚合酶，在６３～６５℃对样品ＤＮＡ模板进行扩增，短时间扩增出大量产物。其鉴定采用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过加入ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ颜色变化判断扩增与否。本发明专利技术的检测方法具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，涉及转基因产品的检测方法，具体 说是一种快速检测转基因玉米BT11的方法，通过肉眼观察反应管浊度或观 察加入IOOO x SYBR Green后颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断扩增情 况。
技术介绍
随着生物技术的飞速发展，基因工程技术为人类食品和动物饲料的供 应提供了新的途径。目前，全球已商业化和正在研究的转基因植物项目中， 大多数与食品和伺料有关，其中已有成熟技术的共有数十个品种、数百个 品系，主要有大豆、玉米、油菜籽、马铃薯、番茄、小麦等。玉米是世界 上重要的粮食作物之一，在其生长过程中受到的危害主要来自病虫害，其 次为杂草。据统计，玉米如不喷施杀虫剂可能造成59%的产量损失。因此， 基因工程技术最早应用在玉米上是开发具有抗虫和抗除草剂特性的转基 因玉米品系。经济合作发展组织(organization for economic cooperation and develclpment， 0ECD) 2000年登记的转基因玉米品系共计18种，主要 改良性状为抗病虫害和耐除草剂等。2000年美国栽种的转基因玉米中72% 属抗虫害特性，24%属耐除草剂，4%则兼具抗虫害及耐除草剂两种特性。转基因玉米BU1为兼具抗虫害及耐除草剂两种特性的品系，其转入的 抗虫基因为Bt系列毒蛋白基因的CrylAb抗虫基因/转入的耐草丁膦除草剂 基因是草丁膦乙酰转移酶基因。随着大量转基因作物逐步走向市场，转基因作物和转基因作物加工的, 食物的安全性问题也开始受到人们的关注。从本质上讲，转基因作物和常规育成的作物品种没有差别。常规育种一般是通过有性杂交来实现，而植 物基因工程则是用农杆菌、基因枪、电激、微注射等技术将外源重组DNA导入植物基因组中。尽管从理论上讲，转基因的遗传特性及表型应该可以更加精确的预测，在应用上更加安全，但对转基因作物进行安全性评估仍 然很有必要。欧盟最早提出对转基因食品进行标识管理。1999年，要求出口到欧盟 的非转基因产品不得含有1°/。的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最 低限量降低到O. 9%。日本、澳大利亚、新西兰对转基因成分的最低含量做 了不同规定，域值从1-5%不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》， 于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管 理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目 录，并于2002年3月20日起正式实施。目前，PCR检测方法是最主要、最准确地检测转基因作物的方法，包 括定性PCR方法、复合PCR方法、巢式PCR方法、竟争性定量PCR方法、荧光 定量PCR方法等。国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开一种快速检测转基因玉米BT11的方法及根据 外源基因与内源基因接合处序列设计一套引物对其进行扩增，通过肉眼观 察浊度或观察加入SYBR Green后颜色的变化或观察琼脂糖凝胶电泳结果判 断扩增情况。本专利技术的技术方案如下一种用于检测转基因玉米BTll的特异性引物，其中外引物正向序列 AGGGATTCTTGGATTTTTGG,外引物反向序列AGAAATGGTTTCCACCAGAA;内引 物正向序列ATGAAAATAGCCATGAGCGACCATCCATTTCTTGGTCTAAAATCTGT ，内 引物反向序列GGCCATTTATCATCGACCAGAGGAATGTAATCTATGGCAAGGAA。每条引物分别配制成浓度为100jiM的母液，取外引物各ljiL,内引 物各8卩L，灭菌去离子水2juL,充分混合，为引物混合溶液。本专利技术釆用上述一套引物进行快速检测转基因玉来BT11的方法，其特征在于包括如下步骤(1)采用权利要求1所述的4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-65 1C进行45-60min，并且在801C持续 2min， 4C保存；其中的扩增反应体系扩增反应的总体积为25nL,其各种成分分别 为10xBuffer 2. 5 uL， 4M甜菜碱6. 25pL, 0. 2M MgS04 0. 25 ja L，混 合引物lpL, 10jaM dNTPs 3. 5pL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段l-5 HL,模板DNA l-5jaL，用灭菌去离子水补齐到25yL;(2)扩增反应结束，取体系液3-25jiL,采用不同方法判断扩增与否， 包括直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green，通过颜色变化观察有无扩 增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来观察有无扩增反 应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。本专利技术所述的检测方法，其中所述的链置换活性的DNA聚合酶为 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段l-2nL。本专利技术所述的嵌入剂SYBR Green加入量为l-2jiL，浓度为1000倍。本专利技术所述的检测方法，模板DNA指的待测样品采用CTAB法提取纯 化得到的DNA。为了能更加清楚的说明本专利技术的测定方法，下面对本专利技术的试验方法 做以详细的i兌明。1、 原理本方法应用 一种新型的核酸扩增方法，其原理是采用4条特异引物及 一种具有链置换活性的DM聚合酶，在63t:-65X:对核酸进行扩增，短时间 扩增效率可达到l(T-l(r个拷贝。具有高特异性、高效性、快速、筒便、易 检测等特点。2、 引物设计本研究依据转基因玉米BT11外源基因与内源基因结合处序列设计了 4 条引物。引物由上海生物工程公司合成。表l引物序列表如下:__<table>table see original document page 5</column></row><table>Bt-B3 20 AGAAATGGTTTCCACCAGAABt-FIP 47 ATGAAAATAGCCATGAGCGACCATCCATTTCTTGGTCTAAAATCTGTBt-BIP 44 GGCCATTTATCATCGACCAGAGGAATGTAATCTATGGCAAGGAA3、 反应条件反应试剂需要链置换型DNA聚合酶、dNTPs、转基因玉米BT11特异性引 物、甜菜碱、MgSO,和反应緩冲液。反应在恒温条件下进行，反应时间依据 引物的效率和模板DNA质量变化， 一般为lh或更少。加入模板DNA,在63-65 "C进行45-60min，并且在80X:，持续2min而终止。这项技术的优点就是不需要热循环。由于扩增是在恒温条件下进行 的，因此仅需要恒温水浴锅或金属加热块维持反应温度，不需要PCR仪等 昂贵的仪器。 材料与方法(1) 试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍Buffer溶液；特异性引物；甜菜碱溶液；MgSO濃液;dNTPs;(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25pL，其各种成分及终浓度 分别为10 x Buffer 2.5 jaL, 4M甜菜碱6. 25pL, 0. 2M MgS04 0. 25 ji L， 引物混合液ljaL, 10pM dNTPs 3.5jjL, 8000U/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测转基因玉米ＢＴ１１的特异性引物，其特征在于，包括外引物正向序列：ＡＧＧＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴＴＧＧ，外引物反向序列：ＡＧＡＡＡＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡ；内引物正向序列：ＡＴＧＡＡＡＡＴＡＧＣＣＡＴＧＡＧＣＧＡＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＧＴＣＴＡＡＡＡＴＣＴＧＴ，内引物反向序列ＧＧＣＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＧＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＴＧＴＡＡＴＣＴＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＡ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：兰青阔，王永，程奕，赵新，朱珠，
申请(专利权)人：天津市农业科学院中心实验室，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]