本发明专利技术涉及ｔＲＮＡ和氨酰基－ｔＲＮＡ合成酶的正交配对，所述配对能将非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸掺入真细菌细胞，例如大肠杆菌中产生的蛋白质中。本发明专利技术提供，例如但不限于：新型正交氨酰基－ｔＲＮＡ合成酶、编码该新型合成酶分子的多核苷酸、鉴定和制备该新型合成酶的方法、产生含非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸的蛋白质和翻译系统的方法。本发明专利技术还包括通过靶向修饰蛋白质中的苯基硒代半胱氨酸而产生经修饰蛋白质（例如，脂化蛋白质）的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】含非天然氨基酸苯基砸代半胱氨酸的蛋白质的遗传编程表达相关申请的交叉引用本申请要求以下申请的优先权2006年3月16日提交的美国临时申请序列号 60/783，272;2006年11月28日提交的美国临时申请序列号60/861，456 ;两篇申请的内容通过引用全文纳入本文。联邦资助研发下所作专利技术的权利的声明本专利技术在政府的国家卫生研究院(National Institutes of Health)基金号 GM62159的支持下作出。政府对本专利技术享有一定权利。专利
本专利技术涉及翻译生物化学(translation biochemistry)领域。本专利技术涉及制备和利用将非天然氨基酸掺入蛋白质的正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶及其配对的组合物和方法。专利技术背景在历史上，对蛋白质结构和功能的研究依赖于利用天然氨基酸的反应活性基团的可用特性和反应化学特性。不幸的是，从细菌到人类的每种已知生物编码相同的二十种常见氨基酸。这20种氨基酸包含的官能团数目出乎意料地少氮碱基、羧酸和酰胺、醇基团和巯基。R-基团的这种有限选择性约束了对蛋白质结构和功能的研究，即天然氨基酸的化学特性限制了这 些研究。例如，数量有限的天然反应活性R-基团限制了制备高度靶向的蛋白质修饰而排除蛋白质中其它氨基酸的能力。涉及蛋白质的化学选择性连接反应对于各种目的至关重要，包括但不限于研究蛋白质-蛋白质相互作用和细胞信号传导以及产生新型蛋白治疗剂。本领域目前使用的大多数选择性蛋白质修饰反应涉及在亲核和亲电子反应伴侣之间形成靶向蛋白质氨基酸侧链中天然亲核残基的共价键，例如，α-卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况中，选择性由蛋白质中亲核残基的数目和可接近性决定。不幸的是，天然蛋白质通常含有定位不佳的(例如，不可接近的)反应位点或多个反应靶点(例如，赖氨酸、组氨酸和半胱氨酸残基)，从而导致修饰反应的选择性不佳、难以利用亲核/亲电子试剂进行高度靶向的蛋白质修饰。此外，修饰位点通常局限于赖氨酸、组氨酸或半胱氨酸的天然亲核侧链。难以或不可能在其它位点进行修饰。本领域需要为修饰和研究蛋白质结构和功能而将非天然氨基酸掺入蛋白质的新方案，其中所述非天然氨基酸具有新型反应化学特性或其它特性，例如，未在天然氨基酸中发现的生物学特性。本领域急需开发能以高度选择性方式修饰蛋白质而且能在生理条件下修饰蛋白质的蛋白质修饰反应新方案。本领域需要产生蛋白质修饰的新方法，其中所述修饰是高度特异性的，例如没有天然氨基酸发生交叉反应或副反应的修饰。高度特异性蛋白质修饰方案的新型化学方法可应用于蛋白质结构和功能研究以及制备治疗性蛋白质的各领域。蛋白质脂化蛋白质脂化是参与蛋白质定位、正确胞内蛋白质运输和蛋白质-蛋白质相互作用的关键翻译后修饰。蛋白质脂化常是正确的生物学活性所需。该特征对于开发一些治疗性蛋白质而言至关重要。脂化对于研究蛋白质-蛋白质相互作用和细胞信号传导也至关重要。不幸的是，利用天然未脂化形式的蛋白质进行体外化学选择性连接以产生脂化蛋白质极其困难，一般仅限于修饰独特的表面暴露半胱氨酸残基。许多细胞蛋白质的生物学活性需要与细胞膜结合，这取决于半胱氨酸通过脂质残基，例如法尼基、肉豆蘧酰基和棕榈酰基部分的翻译后修饰(Chernomordik和 Kozlov(2003), Annual Review of Biochemistry72 :175-207)。例如，许多 G-蛋白偶联受体是棕榈酰化的。Ras蛋白是法尼基化和棕榈酰化的(Chernomordik和Kozlov(2003), Annual Review of Biochemistry72 :175-207)。虽然蛋白质法尼基化是稳定而不可逆的修饰，但棕榈酰化是可逆的，从而能动态调节蛋白质功能和特异性靶向细胞膜(Rocks等， (2005)，Science307 (5716) :1746-1752)。此外，Y -羧基谷氨酸是凝血连锁中钙依赖性膜附着至关重要的必需修饰(Davie 等，(1991), Biochemistry30 (43) : 10363-10370)。|H交翻译系统克服遗传密码有限的局限性的一种方法是扩大遗传密码并将具有新型反应特性的氨基酸加入生物库(biological repertoire)中。现已开发了在原核和真核生物内将各种非天然氨基酸体内位点特异性地掺入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于在体内多肽翻译期间识别合适的选择者密码子而将所需非天然氨基酸插入规定位置的正交蛋白质翻译组分。这些方法利用识别选择者密码子的正交tRNA (Ο-tRNA)，进而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该Ο-tRNA。这些组分不与宿主生物中任何内源性tRNA、RS、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS 配对能遗传学编码大量结构上有差异的氨基酸。适于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统的实施是本领域公知的，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公开号W02002/086075， 名为“产生正交tRNA-氨酰基-tRNA合成酶配对的方法和组合物”(METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION 0F0RTH0G0NAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS) ;W02002/085923，名为“非天然氨基酸的体内掺入”(IN VIVO INC0RP0RATI0N0F UNNATURAL AMINO ACIDS) ;W02004/094593，名为“扩展真核生物遗传密码” (EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE) ;W02005/019415，2004 年 7 月 7 日提交；W02005/007870，2004 年 7 月 7 日提交；W02005/007624，2004 年 7 月 7 日提交和 W02006/110182，2005 年 10 月 27日提交，名为“用于体内掺入非天然氨基酸的正交翻译组分”(ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)。这些申请各自通过引用全文纳入本文。掺入非天然氨基酸的正交翻译系统及其产生和使用方法的其 它讨论还可参见 Wang 和 Schultz, “扩展遗传密码”(Expanding theGenetic Code), Chem. Commun. (Camb. )1:1-11(2002) ;Wang和 Schultz,“扩展遗传密码"(Expanding the Genetic Code), Angewandte Chemie Int. Ed, 44 (I) :34-66 (2005) ;Xie 和 Schultz, “扩展遗传密石马，，(An Expanding GeneticCode)，Methods36 (3) :227-238(2005) ;Xie 和 Schultz,“扩展的遗传密码”(An Expanding Genetic Co本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种翻译系统，所述系统包含： （ａ）第一非天然氨基酸，其为苯基硒代半胱氨酸； （ｂ）第一正交氨酰基－ｔＲＮＡ合成酶（Ｏ－ＲＳ）；和 （ｃ）第一正交ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）； 其中所述第一Ｏ－ＲＳ用所述苯基硒代半胱氨酸 优先氨酰化所述第一Ｏ－ｔＲＮＡ。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：王江云，PG舒尔茨，
申请(专利权)人：斯克利普斯研究院，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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