用重组ＤＮＡ技术生产与肌苷酸脱氢酥基因区和／或它的侧部区高度同质的ＤＮＡ，它使该基因钝化。该ＤＮＡ及插入该ＤＮＡ的载体可用来转化芽孢杆菌，从而使这些菌株至少能生产肌苷，黄苷和鸟苷中的一种核苷。生产肌苷的该菌株既能高度累积肌苷又很稳定。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生产肌苷的方法。肌苷是合成5′-肌苷酸时作为起始材料的重要物质。本专利技术还涉及生产肌苷酸的新微生物及组建这些新微生物所用的新DNA。人们已知发酵生产肌苷酸是用一种芽孢杆菌(见日本公告专利号2965/1980，41915/1982，42895/1984)，Brevibacterium(日本公告专利5075/1976，见农业生物化学1978年42期399页)或需要腺嘌呤及既需腺嘌呤又具几种药物抗性的类似菌株。用这些菌株是由于它们生物合成嘌呤核苷酸的能力都很强。另一方面，用肌苷酸脱氢酶缺陷型菌株可大量积累肌苷，因为当肌苷酸脱氢酶缺乏时，生产肌苷的一种中间体5′-肌苷酸就可有效地转化为肌苷，而不转化为5′-乌苷酸。为此目的，就常用影印法或用诸如紫外线和亚硝基胍(NTG)处理的突变方法筛选需要黄嘌呤或乌嘌呤的菌株。然而这样得到的营养缺陷型菌株有很多缺点，例如由于它们在有关酶的基因以外其它区域的突变，产率会低于它们的母株，也会在发酵期间由于回复突变而使产率浮动。根据这种情况，本专利技术人研究了如何得到肌苷酸脱氢酶缺陷型菌株，结果用重组DNA技术将为肌苷酸脱氢酶编码的基因DNA并入一个来自该基因外的合适的DNA片段，构建出具有这种染色体DNA结构的新的微生物。本专利技术人发现用这种技术从受体微生物中诱变的新微生物是选自需要腺嘌呤的芽孢杆菌，它们可重复使用于高效稳定地生产肌苷。因为它们可大量积累肌苷，而在发醇过程肌苷脱氢酶活性的回复突变率又低于可观测的标准。本专利技术正是基于这个发现而完成的。因此，本专利技术包括1.为钝化(失活的)肌苷酸脱氢酶编码的DNA，它与芽孢杆菌的肌苷酸脉氢酶基因及/或它的两侧区是同质的。2.上述(1)定义的DNA，它具有插入某一DNA片段的肌苷酸脱氢酶基因区，从而得到所说的失活的基因。3.如上述(2)定义的DNA，其中的DNA片段是除肌苷酸脱氢酶以外的其它基因。4.如上述(3)定义的DNA，其中所说的其它基因是选择标记基因。5.如上述(1)定义的DNA，其中所说的DNA删去肌苷脱氢酶完整基因或它的一部分。6.含有上述〔1〕，(2)，(3)，(4)或(5)所定义的载体。7.用上述(1)-(5)定义的DNA或(6)定义的载体转化的芽孢杆菌。8.生产肌苷的方法，包括在培养基中培养肌苷酸脱氢酶缺陷型的芽孢杆菌，该菌是用为失活的肌苷酸脱氢酶编码DNA转化的，该DNA是与肌苷酸脱氢酶基因区和/或它的两侧区同质的，该菌也可是用插入该DNA的载体转化的，所以该菌可生产肌苷，并可收集培养液中生产出的肌苷。为得到本专利技术所用含肌苷脱氢酶基因的DNA，用常规方法，即用限制性内切酶从微生物染色体DNA中将其切下，例如可根据日本公告专利156388/1985及相应的欧洲专利0151341的方法分离和克隆DNA。在这种情况下，DNA既含为肌苷酸脱氢酶编码DNA，又含少量两侧部分的DNA;然而，含有部分肌苷酸脱氢酶基因的DNA或既含部分该基因又含两侧基因的DNA都可应用。根据上述定义，任何提及的DNA均可用做肌苷酸脱氢酶的整个区，只要该区为一个长1.85千对碱基的XbaⅠ-HincⅡ片段。作为肌苷酸脱氢酶给体，原则上可用任何的微生物，只要它的肌苷酸脱氢酶区碱基序列与受体芽孢杆菌菌株的该酶编码DNA序列是高度同质的。从操作的角度最好用芽孢杆菌的，因为它自我无性繁殖，得到的转化体稳定。给体不一定必需是能生产肌苷，乌苷、黄苷或它们相应碱的菌株。但所用菌株必须不是肌苷酸脱氢酶缺陷型的。可用作给体芽孢杆菌菌株的例子诸如枯草杆菌，短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，具体可提及下列已知菌株枯草杆菌NA-6011(IFO14189.FERMBP-291)枯草杆菌NA-6102(IFO14190，FERM BP-292)枯草杆菌NA-7821(IFO14368，FERMBP-618)枯草杆菌NA-6128(IFO14373，FERMBP-617)枯草杆菌NO-115(IFO14187)枯草杆菌NO168(BGSC NoIAI)枯草杆菌MI114(基因124，255〔1983年〕)短小芽孢杆菌(FERMP-2116)短小芽孢杆菌(FERMP-4832)短小芽孢杆菌(FERMP-4829)地衣芽孢杆菌ATCC8480地衣芽孢杆菌IFO12485BGSC;芽孢杆菌遗传物质贮存中心IFO;大阪，发酵研究所FERMP;国际贸易与工业部，工业科技司，发酵研究所(FRI)。FERMBR;FRI是布达佩斯条约指定贮存单位的编号。此外，来自芽孢杆菌已克隆的肌苷酸脱氢酶基因当然可用着本专利技术DNA的给体。将枯草杆菌NA-6012肌苷酸脱氢酶基因插入PBR322，经过克隆得到的PE×117就是一例。(日本公告专利156388/1985)。PE×117可从大肠杆菌PE×117，用“分子克隆实验室手册”的方法萃取。(T.Maniatis等人，冷泉港实验室，于1982年由University of Tokyo Press出版，86-93页)。为组建和分离本专利技术的DNA，用重组DNA技术是很方便的，EK系统适用于宿主-载体系统。可用作宿主的菌株包括由大肠杆菌K-12衍生的菌株如;大肠杆菌C600(见“分子克隆”504页)，大肠杆菌JA221(IFO14359)，和大肠杆菌294〔美国国家科学院学报1976年73卷4174页〕及从它们衍生的其它菌株〔如从C600衍生的大肠杆菌X-895(IFO14308，FERM BP-614)〕。可用的载体包括PBR322，PACYC184，PACYC177，PUC18，PUC19，PHSG396和PHSG298。本专利技术的新DNA可用下述步骤从含肌苷酸脱氢酶基因的质粒中分离和组建。用常规方法酶解含肌苷酸脱氢酶基因的质粒得到所需DNA，再将分别切下的DNA片段插入，如果需要的话可再用诸如蔗糖凝胶电泳方法萃取和分离各片段，将所需DNA与各片段混合，如果它们有同样粘性末端就直接用T4DNA连接酶将其连接在一起，如果没有相同粘性末端，就先将其粘性未端转化为平钝末端，再用T4DNA聚合酶使其连在一起。酶解含肌苷酸脱氢酶质粒时，可用任何内切酶。只要它们在相关基因上有切点即可。但最好使用在相关基因有较少切点，在其它基因无切点的内切酶。如AflⅡ，APaⅠ，AXyⅠ，BamHⅠ，BClⅠ，BglⅡ，BstEⅡ，ClaⅠ，EcoRⅠ，Eco8IⅠ，HpaⅠ，HindⅢ，KpnⅠ，MluⅠ，NcoⅠ，PstⅠ，SacⅠ，SacⅡ，SalⅠ，SmaⅠ，SphⅠ，SplⅠ，SspⅠ，StuⅠ，XbaⅠ和XhoⅠ。在本专利技术中，不管什么来源的DNA片段均可插入肌苷酸脱氢酶基因区，只要它可使该基因钝化，因此可包括原核生物和真核生物的DNA片段。在实际应用中含有选择标记的DNA片段最有用，因为它既可使肌苷酸脱氢酶钝化，又易于筛选转化体。任何基因均可作为选择标记，只要它能在芽孢杆菌中表达，但最好选择也能在大肠杆菌中表达的基因。这种情况下，在芽孢杆菌及在大肠杆菌中的选择基因表达可能是“连续解读”型的(“read-through”)，因而所插入DNA片段并不总是需要在有关宿主中具有自身的表达启动子。作为这种标记基因的例子。可提及药物抗性基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
为钝化〔失活〕的肌苷酸脱氢酶编码的ＤＮＡ，它与枯草杆菌的肌苷酸脱氢酶基因区和／或它的侧部区高度同质。
【技术特征摘要】
JP 1986-12-26 311588/861.为钝化(失活)的肌苷酸脱氢酶编码的DNA，它与枯草杆菌的肌苷酸脱氢酶基因区和/或它的侧部区高度同质。2.根据权利要求1所述DNA，该DNA具有插入一个DNA片段的肌苷酸脱氢酶基因区，从而使该基因钝化(失活)。3.根据权利要求2所述DNA，其中所述的DNA片段是一个除肌苷酸脱氢酶基因以外的其它基因。4.根据权利要求3所述DNA，其中所述的其它基因是一个筛选(选择)标记基因。5.根据权利要求4所述的DNA，其中所述的选择标记基因是选自下面一组的一个或多个基因药物抗性基因，氨基酸合成基...
【专利技术属性】
技术研发人员：宫川权一郎，木村宏之，隅野靖弘，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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