一种多肽－人蛋白激酶35和编码这种多肽的多核苷酸制造技术

一种分离的多肽－人蛋白激酶３５，其特征在于它包含有：〈２１０〉２所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术描述了一种新的多肽——蛋白激酶35，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本专利技术还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。
技术介绍
自真核生物中鉴别的一类最大的已知蛋白超家族由蛋白激酶组成(这儿使用超家族以区别于较小 较为密切相关通常已被归为一个家族的亚型)，该家族成员都有一段保守的催化核心，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶的保守催化核心相同。这些酶利用ATP(或GTP)的γ-磷酸酯以生成磷酸单酯，并把蛋白(丝氨酸及苏氨酸上)的乙醇基团与/或蛋白(酪氨酸上)的酚基作为磷酸酯受体。真核生物蛋白激酶可分为四大类1)ACG类，包括环核苷酸依赖家族(PKA与PKG)，蛋白激酶C(PKC)家族，β-肾上腺素能受体激酶(βARK)家族，核糖体S6激酶家族及其他密切相关的；2)CaMK类，包括由钙/钙调蛋白调控的蛋白激酶家族，Snfl/AMPK家族，及其他密切相关的；3)CMGC类，包括细胞周期蛋白依赖激酶，Erk(MAP)激酶家族，糖原合成酶3(GSK3)家族，酪蛋白激酶II家族，Clk(类似Cdk的激酶)家族，及其他密切相关的；4)‘保守的’蛋白酪氨酸激酶(PTK)类。该超家族又可分为两个主要的亚门蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶。真核生物蛋白激酶的激酶功能域传递催化活性。蛋白激酶因其同源激酶功能域(亦被称为催化功能域)而相关，该区域有250-300个氨基酸残基。激酶功能域的作用可分为三类1)结合并定向作为具有二价阳离子(通常是Mg2+或Mn2+)复合物的ATP(或GTP)磷酸酯供体；2)结合并定向蛋白(或肽)底物；以及3)转移ATP(或GTP)的γ-磷酸酯至蛋白底物的受体羟基残基(丝氨酸，苏氨酸，或酪氨酸)。激酶功能域被进一步分为12个更小的亚功能域，并定义为从未被大的氨基酸插入打断并含有保守残基特征序列模式的区域。有十二个功能域残基因在超家族中被视为是恒定不变的，而明显意味其在酶功能中具有重要作用，它们是亚功能域I中的甘氨酸50及甘氨酸52，亚功能域II中的赖氨酸72，亚功能域III中的谷氨酸91，亚功能域VIB中的天冬酰胺171及天冬氨酸166，亚功能域VII中的天冬氨酸184及甘氨酸186，亚功能域VIII中的谷氨酸208，亚功能域IX中的天冬氨酸220及甘氨酸225，亚功能域XI中的精氨酸280。在亚功能域VIB，VIII，及IX中发现的氨基酸残基特征序列模式在不同蛋白激酶家族的各成员中尤为高度保守。激酶功能域的同源性意味着它们都折叠成拓扑结构相似的3维核心结构并根据一个普遍的机制传递磷酸转移。蛋白激酶催化核心结构的一般拓扑结构可以PKA-Cα类蛋白激酶为代表。PKA-Cα类蛋白激酶的激酶功能域折叠成两部分结构。较小的一部分，NH2-端部分，含有亚结构域I-IV，主要参与核苷酸固定兼定向。这一部分具有显著反向平行的β-片层结构，这在核苷酸结合的蛋白质中是较为独特的。较大的COOH-端部分，含有亚结构域VIA-XI，主要对结合肽底物及启动磷酸转移起作用，其内含物是显著的α-螺旋。亚结构域V残基有两片。两片中间较深的裂缝作为催化位点被识别。另外四种真核蛋白激酶超家族成员-细胞周期蛋白依赖的激酶2(Cdk2)，p42MAP激酶(Erk2)，颤动激酶，以及酪蛋白激酶I的激酶功能域被发现折叠成两部分结构，拓扑结构上与PKA-Cα催化核心极为相似。然而，在Cdk2及Erk2结构中的亚结构域VIII对应的区域中发现了显著差异，说明这些是非活性状态的酶结构。颤动结构也属于非活性酶，但它是因位于激酶功能域的COOH-端侧的自身抑制肽序列的存在而失活，并向背面折叠到两片之间的活性位点的裂缝中去。这条肽链迫使两个片层几乎朝对方旋转30°，在这一构像中，失活的颤动与无PKI的PKA-Cα的开放构像更为相似。在颤动及Cdk2中亚功能域III中的α-螺旋C均采用一种不同于PKA-Cα中螺旋C的位置。本模板是从蛋白激酶的催化区域的十二个亚功能域中选择了两段构建特征序列模式，第一个区域位于催化域的N-端，亚功能域I，是一段富含甘氨酸的序列，在涉及ATP结合的赖氨酸残基附近。它含有一共有序列的基序Gly-x-G1y-x-x-Gly-x-Val，激酶功能域NH2-端结合位点在基序中第一个甘氨酸上游的第七个位置，该位置上通常可找到疏水性残基。亚功能域I残基折叠成β-链-转角-β-链结构围绕β-链1与2，这一结构作为可弯曲的片层或夹子覆盖并定位ATP不可转移的磷酸酯而作用。丝氨酸53，苯丙氨酸54，以及甘氨酸55的主链酰胺与ATPβ-磷酸氧形成氢键。亮氨酸49及缬氨酸57形成疏水袋，它把ATP的腺嘌呤环围住。第二个区域位于催化域的中心，含有一保守的天冬氨酸残基，对于酶的催化活性极为重要，即亚功能域VI。亚功能域VIA折叠成大的疏水性α-螺旋E，延伸穿过功能域两部分中大的部分。螺旋E中没有残基直接与MgATP或肽底物作用；因而这部分分子主要作为支撑结构来作用。亚功能域VIB折叠成带间插环的小的疏水性β-链6与7。其中包括两个不变的残基(在PKA-Cα中为天冬氨酸166及天冬酰胺171)，它们位于相同的基序组氨酸-精氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-赖氨酸-X-X-天冬酰胺之中(HRDLKxxN)。间插环被认为是催化环，因为环中的天冬氨酸166作为催化基质出现，接受磷酸转移机制过程中底物的羟基基团中的质子。环中的赖氨酸168(在保守的蛋白酪氨酸激酶中由精氨酸取代)可能有助于通过中合转移过程中的γ-磷酸酯负离子便于磷酸转移。天冬酰胺171的侧链通过与天冬氨酸的主链羰基形成氢键有助于稳固催化环，它还螯合桥连ATP的α-及γ-磷酸酯的次级Mg2+离子。谷氨酸170的羰基与一个ATP核糖体羟基基团形成氢键。谷氨酸170还通过与肽识别共有序列的第二个精氨酸形成离子对而参与结合底物。由于如上所述蛋白激酶35蛋白在机体重要功能中起重要作用，而且相信这些调节过程中涉及大量的蛋白，因而本领域中一直需要鉴定更多参与这些过程的蛋白激酶35蛋白，特别是鉴定这种蛋白的氨基酸序列。新蛋白激酶35蛋白编码基因的分离也为研究确定该蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础。这种蛋白可能构成开发疾病诊断和/或治疗药的基础，因此分离其编码DNA是非常重要的。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供分离的新的多肽——人蛋白激酶35以及其片段、类似物和衍生物。本专利技术的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。本专利技术的另一个目的是提供含有编码人蛋白激酶35的多核苷酸的重组载体。本专利技术的另一个目的是提供含有编码人蛋白激酶35的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。本专利技术的另一个目的是提供生产人蛋白激酶35的方法。本专利技术的另一个目的是提供针对本专利技术的多肽——人蛋白激酶35的抗体。本专利技术涉及一种分离的多肽，该多肽是人源的，它包含具有<210>2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段或衍生物。较佳地，该多肽是具有<210>2氨基酸序列的多肽。本专利技术另外涉及一种含有本专利技术多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体遗传工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和回收本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：毛裕民，谢毅，
申请(专利权)人：上海博德基因开发有限公司，
类型：发明
国别省市：