一种启动子序列，它具有如序列表ＳＥＱ ＩＤ：１所示的核苷酸序列及其功能等同序列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种棉花基因组中的ADP-ribosylation factor 1(arf1)基因及其启动子序列。该基因及其启动子可在棉花的花蕾、花、纤维及其棉铃铃壳中优势表达。该基因及其启动子可用于棉花生殖器官的发育、品质改良以及外源基因在棉花生殖器官中的特异表达研究。
技术介绍
棉纤维是已知纤维素纯度最高的天然资源之一。它成本低廉，产出量大，且具有吸湿、通气、保暖性好，不带静电，手感柔软等人造纤维难以比拟的优点。由于世界纺织工业加工速度的加快和人民生活水平的提高，对棉纤维品质的要求愈来愈高。因此，弄清纤维细胞的表达模式以及可能的生物学功能，系统阐明棉纤维细胞发育调控的分子机理，对充分利用棉花自身基因资源、提高棉花产量、改良纤维品质乃至发展人工棉纤维都具有重要意义(贾士荣，郭三堆，2002，转基因棉花，p265-270)。虽然棉纤维形成和发育的过程已经基本清楚，但对纤维发育的分子机理还知之甚少。分离鉴定与棉纤维细胞分化、伸长和次生壁沉淀等过程相关的基因，了解它们在纤维发育不同阶段的功能及其与纤维品质的关系，可以为利用基因工程方法定向改良纤维品质提供依据。涉及到棉纤维的分化、发育过程中的基因有几千种(贾士荣，郭三堆，2002，转基因棉花，p265-270)。虽然目前已经克隆到几十个棉纤维发育相关基因，且多数是在纤维伸长阶段的纤维细胞中特异表达(JhonM E，1992，Proc Natl Acad Sci USA，895769-5773；Jhon M E，1995，Plant Physiol 1071478-1486；Jhon M E，1996，Plant Molecular Biology 30297-306；1999，New YorkFood Products Press，271-292)。但绝大部分基因在棉纤维发育中的确切功能还不清楚或有待确定，因此，还不能有效地应用于纤维品质的遗传改良，棉纤维的转基因改良已有一些成功实例，但由于目标基因缺乏，利用分子生物学方法改良棉纤维的潜力还远没有发挥(贾士荣，郭三堆，2002，转基因棉花，p265-270)。小G蛋白是一类重要的信号转导蛋白，在真核生物基因的表达调控中起到重要作用(Terryn N.，MontaguM.V.，1993，The plant Cell，.51761-1769.)。至于在棉纤维发育过程中的作用，Delmer等人从棉花cDNA文库中筛选出2个与哺乳动物rac基因高度同源的克隆Rac13和Rac9，其中Rac13在棉纤维发育过程中优势表达，且于纤维伸长向次生壁增厚的转换期表达量达到最大。Rac13编码的蛋白可参与调控细胞骨架形成的信号转导(Delmer D P，Pear J R，1995，Mol Gen Genet，4843-51)。ADP-ribosylation factor 1(arf1)是属于Ras小G蛋白超级家族中的ARF亚族，在真核生物中普遍存在并高度保守。人类和植物的arf1基因均可互补于酵母arf1突变株。ARF1是高尔基体/内质网运输小泡的重要组成部分和调控因子，在物质运输系统中起到重要的调控作用(Lee M H，Min M K，2002，Plant Physiology，129(4)1507-1520)。ARF1在胞内细胞膜运输中起重要作用，尤其是芽生小泡的关键调控因子。在酵母中对arf1基因进行突变研究，结果出现了对低温敏感、生长缓慢、对氟敏感、多种分泌突变等表型(Yahara N，Ueda T，2001，Molecular Biology of the Cell，12，221-238)。在拟南芥细胞中的研究表明arf1在内织网和高尔基之间的小泡运输起重要作用，并且对维持高尔基体的正常形态结构至关重要(Takeuchi M，Ueda T，2002，The Plant Journal 31(4)499-515)。另外，Arf1在质膜和细胞质之间生长素的极性运输中起到重要作用。目前尚未见到arf1基因参与棉纤维发育、形成的报道。有人通过RNA斑点杂交证明在棉花中，ARF1主要在花器官的各种组织中高效表达，而在根、茎、叶等生殖器官中不表达。(候磊等，2002，遗传学报，29(4)359-363)。这说明在棉花中ARF1的顺式调控元件具有生殖器官组织特异性。但到目前为止，国内外尚未见到对arf1基因及其启动子在棉纤维及棉花生殖器官中的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种与棉纤维发育有关的基因arf1基因。它全长为3609bp(如序列表SEQ ID2所示)，具有7个外显子和6个内含子(如图3所示)。其含有一个1125bp的ORF结构(如序列表SEQ ID3所示)。Northern blot结果证明，它在棉纤维及棉花生殖器官中呈优势表达，在国内外尚未见到有类似报道。本专利技术的另一个目的是提供一种新的棉纤维发育有关的启动子(如序列表SEQ ID1所示)，该启动子DNA序列上具有Initiator、TATA box、CCAA box和GC box等明显启动子特征序列(如图3所示)。Northernblot结果证明，该启动子驱动的arf1基因在棉纤维及棉花生殖器官中优势表达(如图4所示)。在国内外尚未见到有类似报道。本专利技术的再一个目的是提供一种新的棉纤维及棉花生殖器官优势表达的蛋白质(如序列表SEQ ID4所示)。Arf1蛋白，它具有181个氨基酸(如序列表SEQ ID4所示)。本专利技术再一个目的是提供一种我们自己独创的同尾酶反向PCR(isocaudarner inverse PCR，II-PCR)技术，在棉花基因组上连续步移，获得了棉花arf1上游1865bp的DNA序列(如图2所示)。再用我们自己独创的快速分离目的基因cDNA-5”未知序列和启动子(rapid isolation of cDNA 5’unknown sequence and promoter，RICUP)的技术，获得了arf1的全长cDNA序列和启动子(如图3所示)。下面结合附图对本专利技术做进一步说明附图表说明附图说明图1为从棉花基因组中用PCR扩增的arf1基因的4924bp DNA序列的琼脂糖凝胶电泳图。图2为用反向PCR和同尾酶反向PCR进行染色体步移扩增到棉花arf1基因上游1865bp DNA序列的琼脂糖凝胶电泳图及II-PCR流程示意图。图3为棉花arf1基因全长cDNA的步移和启动子定位过程琼脂糖凝胶电泳图及RICUP流程示意图。图4为用Northern blot确定启动子在棉花生殖器官中高效表达。1、2、3、4、5、6、7分别代表棉花根、茎、叶、蕾、花、铃壳和纤维中提取的总RNA电泳泳道具体实施方式实施例1棉花arf1基因上游1865bp DNA序列的分离克隆1 DNA和RNA模板的制备用改良的CTAB法提取陆地棉品种Y18基因组DNA，要求DNA片段大于50Kb，OD260/OD280大于1.8。采用改良的热硼酸法提取陆地棉品种Y18 7-10dpa纤维总RNA，用于cDNA序列扩增和未知cDNA序列步移。2用RT-PCR获取棉花ARF1基因EST序列的3’端全长和相应的DNA序列RT-PCR按照TaKaRa RNAPC本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭三堆，任茂智，张锐，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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