本发明专利技术涉及“一种核糖体灭活蛋白基因”，属于生物技术领域。本发明专利技术通过减法杂交等方法，以水稻为具体实施材料，克隆出一种新核糖体灭活蛋白基因（ＲＡ３９）。该基因与已知基因没有同源性，并编码一种核糖体灭活蛋白（ＲＡ３９ｐ）。本发明专利技术利用原核表达系统成功地获得具有活性的重组核糖体灭活蛋白。本发明专利技术所涉及的基因可用于通过原核和／或真核表达载体生产重组的核糖体灭活蛋白，研制生物防治制剂；也可使用组成型启动子（如３５Ｓ启动子）或器官特异性启动子构建（ＲＡ３９）基因表达构建体，通过转基因技术提高植物体内核糖体蛋白的表达量，以改良植物的抗病特性；也可利用反义基因研究植物生殖发育的调控技术（如雄性不育）等，具有重要的应用价值。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
技术介绍
核糖体灭活蛋白(ribosome-inactivating proteins，RIPs)是自然界分布较为广泛的一类植物蛋白质，在植物的根、叶、种子中均有分布(Bass等，Plant Cell，1992，4225-234；Vivanco等，Plant Physiol，1999，1191447-1456；Krawetz等，Eur J Biochem，2000，2671966-1974；Van Damme等，Eur J Biochem，2672746-2759；Song等，Plant Mol Biol，43439-450)。根据RIPs的分子结构特征，将其分为三类，即I型、II型和III型。其中，I型RIPs是一类单亚基酶，如商陆抗病毒蛋白(pokeweed antivirusprotein，PAP)和栝楼(Trichosanthes kirilowi)的天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)；II型RIPs是由两条链组成的杂合二聚体，其中A链相当于I型RIPs，B链是凝集素类多肽，能与特定的细胞膜上的受体结合，具有将RIPs导入细胞的功能，如蓖麻(Ricinus communis)毒蛋白(ricin)；III型RIPs也是一个单链多肽，但其合成时是以酶前体形式存在的，经过翻译后加工除去前体中间的一段序列，才能转变成有活性的RIPs，目前该类RIPs仅在玉米和大麦中被发现(Van Damme等，Eur J Biochem，2000，2672746-2759)。虽然RIPs的氨基酸序列变异较大，但它们的共同特点是具有N-糖苷酶活性，能水解核糖体大亚基RNA颈环上特定位点上的腺嘌呤，干扰核糖体与蛋白质合成延伸因子EF-Tu和EF-G的结合，从而抑制蛋白质合成。近几年的研究结果已证明RIPs在植物的防御反应中起着重要作用，是一类广谱抗菌和抗病毒蛋白。例如，来源于紫茉莉(Marabilis jalapa)储藏根中的RIP(MAP)能够抗烟草花叶病毒、马铃薯病毒X、马铃薯病毒Y和马铃薯纺锤块茎类病毒等对农业生产有极大危害的病毒(Kubo等，Ann Phytopathol SocJpn，1990，56481-487；Kataoka等，J Biol Chem，1991，2668426-8430；Kataoka等，Plant Mol Biol，1992，201111-1119；Vivaco等，Plant Physiol，1997，1191447-1456)。用紫茉莉根粗提取物喷撒马铃薯植株，能授予其稳定的抗病毒能力(Vivaco等，Plant Physiol，1997，1191447-1456)。又如，转天花粉蛋白基因的烟草对胡罗卜花叶病毒(turnip mosaic virus，TuMV)和非洲木薯花叶病毒(african cassava mosaic virus，AcMV)均具有抗性(王莉江等，《生物技术通报》，2000，(2)1-4)。RIPs也具有较强的抗真菌和抗细菌的活性，并具有杀虫能力(Gatehouse等，Entomol Exp Appl，1990，5443-51；Vivaco等，Plant Physiol，1997，1191447-1456；Nielsen和Boston，Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52785-816)。例如，蓖麻毒蛋白(ricin)和相思子(Abrus precations)的RIP(abrin)均具有很强的杀虫活性，例如，浓度为0.001-0.0001％的蓖麻毒蛋白可使鞘翅目的四纹豆象和棉龄象甲致死(Olsnes等，Biochemistry，1973，123121-3126；Olsnes等，Eur J Biochem，1973，35179-185；Gatehouse等，Entomol Exp Appl，1990，5443-51)。又如，转玉米或大麦RIPs基因的烟草显示出较强的抗真菌能力(Jach等，Plant J，1995，897-109；Maddaloni等，Transgenic Res，1997，6393-402)；转天花粉蛋白基因水稻具有抗稻瘟病能力(明小天，北京大学博士研究生毕业论文，2000)。除此之外，最近的研究显示，天花粉蛋白和其他一些RIPs有抑制HIV和肿瘤细胞生长以及调节免疫系统的功能，如在离体条件下，可以抑制HIV、乙型脑炎和乙肝病毒(Au等，FEBS lett，2000，471169-178；Nielsen和Boston，Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52785-816)。可以说，虽然核糖体灭活蛋白的应用研究目前还处在初期阶段，但初步的研究成果已显示出其在改良植物的抗病能力和提高人类健康的研究中具有巨大的应用前景。鉴于RIPs在农业与医药中重要的应用前景，在世界范围内，RIPs被作为一种重要的分子资源来开发，目前已从一些植物的根、叶和种子中鉴定出近50种不同的RIPs(Barbieri等，Biochem Biophys Acta，1993，1154237-282；Nielson和Boston，Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52785-816)。但是，大多数工作仅限于通过层析等技术对RIPs蛋白质的分离与活性分析上(Vivanco等，Plant Physiol，1999 1191447-1456；Krawetz等，Eur JBiochem，2000，2671966-1974)。目前，已报道了近20个不同RIPs基因序列。这些工作主要集中在长叶黄精(Polygonatum multiflorum)(注册号AF213983，AF213984)，西洋接骨木(Sambucus nigra)(注册号AF409135，U66191，AF012899)，樟树(Cinnamomum camphora)(注册号AY039801，AY039802；AY039803)，鸢尾(Iris hollandica)(注册号U78039，U78040，U78041)，栝楼(Trichosanthes kirilowi)(注册号AB000666)和大麦(注册号M62905，M36990)等植物上。利用计算机联网分析，共检索到8个专利，其中7个是美国专利(US 5744580，US 5756699，US 6146631，US 5416202，US 5621083，US 5635384，US 5646026)，一个是德国专利(W09829540)。这些专利涉及的内容包括核糖体灭活蛋白组成的免疫毒性制剂(US 5744580，US 5756699，US 6146631，US 5416202，US5621083)，核糖体灭活蛋白非活性前体的加工与应用方法(US 5635384，US5646026)和欧洲白果槲寄生的重组核糖体灭活蛋白(W09829540)。
技术实现思路
技术问题本专利技术利用减法杂交技术从水稻花药中克隆一种尚未见报道的核糖体灭活蛋白基因RA39。该基因在花药绒毡层特异表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核糖体灭活蛋白基因（ＲＡ３９）的ｃＤＮＡ序列，其特征是该ｃＤＮＡ序列具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王台，丁兆军，吴孝槐，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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