极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因的克隆及应用属分子生物学和生物工程技术领域，本发明专利技术提供极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：1所示；同时提供：极端嗜盐曲霉核糖体蛋白，它由极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因序列编码、其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：2所示；重组原核表达载体含有极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因；重组原核表达载体转化的大肠杆菌细胞；本发明专利技术极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因的应用，能提高酵母菌株的抗盐能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属分子生物学与基因工程
，具体涉及一种极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因的克隆及应用。
技术介绍
高浓度的盐引起植物体内的离子失衡和高渗胁迫，导致植物发育不良、生长缓慢， 特别是降低农作物产量。严重的盐胁迫或渗透胁迫会引起植物体内的第二胁迫-氧化胁迫的发生，甚至导致植物死亡。因此，盐胁迫受到人们的广泛关注，提高作物的耐盐性亦愈来愈受到人们的重视。通过转基因提高作物的耐盐能力是一种行之有效的办法。因此，寻找与盐胁迫有关的基因并研究其具体功能，以及调控途径具有重要的理论和实践意义。在所有活细胞中，核糖体是蛋白质合成所必需的细胞器。核糖体蛋白是组成核糖体的主要成分，它通过促进核糖体RNA折叠而使之处于最利于其执行翻译功能的构象状态，而提高蛋白质生物合成的效率和准确度，参与细胞增殖、分化和凋亡，在生物体的生长、 发育中起着关键性的作用。核糖体蛋白(RP)是核糖体的重要组成部分，在核糖体的翻译过程中起重要的作用，例如对rRNA进行折叠，形成有功能的三维结构；在蛋白质合成过程中对核糖体的空间构象进行调整；在核糖体的结合位点上协同rRNA催化蛋白质的合成。2001 年，Uechi等成功绘制出了全部80条RPG的遗传物理图谱，将80条RPG定位于2条性染色体和20条常染色体(除7号和21号常染色体)上，同时80条RPG的序列也已确定。到目前为止，80种RP中的75种，其氨基酸序列已确定，这为进一步研究奠定了基础。目前已知 RP在进化过程中高度保守，RP氨基酸序列在几乎所有哺乳动物中均相同，酵母菌RP与人类 RP极其相似，原核细菌和真菌的RP数量比人类少得多，其氨基酸序列仍与人类相似。过去一直认为RP的合成在转录和翻译过程中都进行了调控，近年来通过DNA芯片技术证明RP 的mRNA转录水平与细胞的生长条件保持严格的一致，表明转录水平的调控在RP合成中起到了主导作用。核糖体蛋白进化过程中高度保守的，在核糖体的生物合成或成熟的核糖体功能中是至关重要的。此外，核糖体蛋白具有不同的额外的核糖体的功能，如细胞凋亡，DNA修复和转录。越来越多关于核糖体蛋白的数据已经证明，许多核糖体蛋白可以调节反式激活功能调控因子如NF-JB，P53，c-Myc和核受体调节蛋白等。此外，核糖体的一个亚基蛋白质可以直接绑定到mRNA的非翻译区，进而导致受到本身核糖体的特异性的转录的翻译。总的来说，这些研究结果表明，核糖体蛋白可能存在一个更广泛的功能。近年来发现，在核糖体蛋白中存在着可与DNA结合的特征结构，人们由此推测，由核糖核酸(RNA)转变为核蛋白体的核糖体可能是在RNA上添加一些本来就存在的蛋白后形成的。人们还观察到，多种核糖体蛋白除组成核糖体外还具备其他的功能。核糖体蛋白是组成核糖体的主要成分，在细胞内蛋白质生物合成中发挥重要作用。近来人们发现，核糖体具有参与DNA修复、细胞发育调控和细胞分化等核糖体外功能。 核糖体蛋白质的一个亚基可以直接控制基因的转录或转录调节。首次发现在人类核糖体蛋白K(核蛋白K)和KH域结合RNA或DNA。RPS3结构之中发现NF-JB Ρ65同源二聚体和亚基P65-P50DNA的异质二聚体协同约束力的复合物增强了 DNA结合。RPS3损失产生负面影响NF-JB能够诱导基因表达的变化。RPS3也参与其他额外的核糖体的活动，它可以作为一种DNA修复内切酶或caspase依赖的细胞凋亡诱导剂。已有研究表明RPS3核糖体蛋白除了组成核糖体的主要成分之外，在细胞内蛋白质生物合成中发挥重要作用，还具有DNA修复、细胞发育调控和细胞分化等核糖体外功能。 在众多的研究中，并没有看到在极端嗜盐曲霉RPS3核糖体蛋白的研究，而极端嗜盐曲霉作为一种具有嗜盐性的物种，对外界环境的适应能力比较强，在极端嗜盐曲霉中一定存在多抗基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于(1)提供一种DNA序列，其编码一种极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因，命名为SpRPS3ae ;(幻提供一种利用基因工程方法得到极端嗜盐曲霉核糖体蛋白； (3)提供极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因SpRPS3ae在菌株抗盐基因工程方面的应用。本专利技术提供了一种极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因SpRPS3ae，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。从实验室中一种极端嗜盐曲霉cDNA文库中，利用PCR方法筛选克隆出极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因SpRPS3ae 利用RNAiso Reagent (购自大连Takara公司)提取极端嗜盐曲霉CCHA总RNA，由上海intrigeon公司合成极端嗜盐曲霉CCHA cDNA文库，从极端嗜盐曲霉酵母表达文库中，筛选出抗盐转化子，测序得到编码SpRPS3ae的序列，根据此序列设计上下游引物，并以极端嗜盐曲霉CCHA cDNA为模板进行PCR扩增，克隆出SpRPS3ae的全长基因。极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因SpRPS3ae由774个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架，为序列表中的SEQ ID N0:1序列。开放读码框的起始密码子为ATG，终止密码子为 TAG。本专利技术还提供了一种极端嗜盐曲霉核糖体蛋白，它是由一种极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因SpRPS3ae序列编码，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示，是含有161个氨基酸残基，其分子量大小为18. 60938kDa，预测等电点为10. 45。一种重组原核表达载体含有极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因SpRPS3ae，重组原核表达载体转化的大肠杆菌细胞。如实施例二所述，还可利用基因工程的方法，在高效大肠杆菌表达系统中表达出具有生物活性的极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因SpRPS3ae。关于在酵母抗盐基因工程方面的应用一种极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因SpRPS3ae在酵母菌株抗盐基因工程方面的应用。本专利技术的有益效果在于提供了一种极端嗜盐曲霉的核糖体蛋白基因SpRPS3ae及蛋白，构建了原核表达载体，并将验证正确的原核表达载体转入BL21表达菌株中诱导表达，通过高盐、中盐和低盐胁迫后观察测定菌落生物活性，分析极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因SpRPS3ae可提高菌株抗盐的能力。附图说明图1为以极端嗜盐曲霉CCHA cDNA为模板，PCR扩增电泳图其中M:marker 自上到下大小为1849bp、1050bp、73m3p、424bpJ80bp1、2、3:目的条带图2为SpRPS3ae原核表达载体的构建过程示意图 图3为SDS-PAGE原核表达全蛋白电泳图其中M=Marker 从上至下为 97、66、43、31 (kDa)1、2 含有重组克隆质粒pET_32a :SpRPS3ae的BL21宿主菌全蛋白CK 含有空载体质粒pET_32a的BL21宿主菌全蛋白图4为低盐胁迫后酵母菌株生活力平板菌落示意5为中盐胁迫后酵母菌株生活力平板菌落示意6为高盐胁迫后酵母菌株生活力平板菌落示意4、图5和图6中ff(GS115)野生型酵母菌株GSl 15 ；SpRPS3ae 转SpRPS3ae基因阳性酵母菌株。0% :ff(GS115)和SpRPS3ae未做稀释盐胁迫处理；10% :ff(GS115)和 SpRPS3ae 稀释 10 倍盐胁迫处理；100% :ff(GS115)和 SpRPS3ae 稀释 100 倍盐胁迫处理；1000%本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张世宏，谢丽霞，刘晓丹，贾保磊，魏毅，潘洪玉，刘金亮，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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