作为医药品等有用物质的合成中间体，需要大量并且低价地生产光学活性的泛解酸内酯等γ－内酯衍生物。为了这个目的，利用可进行不对称水解的酶－内酯酶的技术很有优势，不过该酶的制造或该酶产生微生物的利用还存在尚未解决的问题。当使用重组技术时也很难以取得到充分并且稳定的酶活性。用重组技术将成熟内酯酶ＤＮＡ和信号肽区域ＤＮＡ均导入到宿主中生产能够选择性地不对称水解外消旋泛解酸内酯等的γ－内酯衍生物的内酯酶，能够得到天然内酯酶所欠缺的稳定的活性，还能够得到保持高的酶活性并且稳定地保持该活性的转化子，可以有效并且具有工业化优势地不对称合成γ－内酯衍生物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有D-泛解酸内酯水解酶活性的内酯酶的制造方法。本专利技术涉及用微生物表达和分泌生产具有D-泛解酸内酯水解酶活性的内酯酶。此外，本专利技术涉及使用该酶和使用生产该酶的系统制造光学活性γ-内酯及其相关化合物的方法。
技术介绍
已知D-泛解酸内酯是制造D-泛酸、D-泛醇、双泛酰巯乙胺的中间体。上述物质作为医学上或生理学上重要的维生素除了用于医药品之外，还用作食品添加剂、饲料添加剂，此外还用作化妆品原料。以前，通过光学拆分化学合成的D、L-泛解酸内酯制造D-泛解酸内酯。不过，这种方法存在需要奎尼酸、番木鳖碱等高价的拆分剂，并且存在不容易回收D-泛解酸内酯等缺点。为了解决上述问题，本专利技术人等在专利文献1和专利文献2各公报提出了用酶对D、L-泛解酸内酯的不对称水解进行光学拆分的方法。即，涉及制造D-泛解酸内酯的方法和用属于下述种属的微生物制造D-泛解酸内酯水解酶的方法，其特征是，从属于镰孢属、柱孢属、赤霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、周刺座霉属、胶霉属、散囊菌属、从赤壳菌属、Schizophyllum、漆斑菌属、链孢霉属、支顶孢属、锈生座孢属、犁头霉属、Sporothrix、轮枝孢属、节皮菌属的微生物中选取具有内酯水解能力的微生物，通过该微生物选择性地不对称水解D、L-泛解酸内酯中的D-构型，使之生成D-泛酸，分离该D-泛酸，转换成D-泛解酸内酯。可是，其中公开的多数微生物不一定具有可在工业上应用程度的水解活性，为了使相应的微生物所具有的酶活性上升到可以在工业水平应用的程度，必须对培养条件或活性诱导条件等花费长时间进行复杂而艰难的研究。此外，因为其中相应的微生物是真菌，所以菌体呈现多种形态的菌丝状，和具有单一形态的细菌等相比，在制造成对工业生产有利的固定化菌体方面存在相当大的难度。而且，从菌体中纯化酶的时候，存在D-泛解酸内酯水解酶回收率相当差的问题。为了解决上述各个问题，并且通过改变D-泛解酸内酯水解酶实现使酶活性产生飞跃性上升的目的，明确了编码天然D-泛解酸内酯水解酶例如源自尖孢镰孢属(Fusarium oxysporum)的天然的D-泛解酸内酯水解酶或与之本质上具有同等活性的蛋白质的基因，并且制造转化后含有编码该蛋白质的碱基序列的DNA的宿主细胞(专利文献3)，不过需要使由该转化宿主细胞得到的酶活性可以达到在工业上直接应用的更为有效的方法。专利文献1特开平3-65198号专利文献2特开平4-144681号专利文献3国际公开小册子WO，A，97/10341
技术实现思路
以前用大肠杆菌等得到的转化子存在所生产的酶不能添加糖链、比天然型(野生型)分子量小、缺乏稳定性的问题，一直在寻求解决上述问题的办法。本专利技术利用天然的内酯酶基因，制造出有效并且生产性优异的生产该酶的系统。此外，本专利技术还用该酶和生产该酶的系统，构建了有效并且生产性能更优异的光学活性γ-内酯生产系统。具有D-泛解酸内酯水解酶活性的D-泛解酸内酯水解酶(以下称为“内酯酶”)，尤其是从尖孢镰孢属克隆鉴定的内酯酶，其基因的分析结果表明该酶由含有5个内含子的1453个碱基对的染色体基因所编码，该酶在NH2末端含有20个氨基酸组成的信号肽。与由该染色体基因转录来的mRNA互补的cDNA所编码的成熟酶是380个氨基酸的蛋白质。其野生型酶添加有糖链。鉴于上述问题，本专利技术人等为了开发能够在重组型酶上添加糖链的系统，进行了刻苦的研究，将编码该内酯酶的基因和信号肽的基因序列一起导入到宿主细胞中，使之表达，结果成功地大量表达了添加有天然型糖链的该酶，完成了本专利技术。本专利技术提供〔1〕产生内酯酶的转化子，其特征是，其中导入了编码具有D-泛解酸内酯水解酶活性的内酯酶和信号肽区域的DNA；〔2〕上述〔1〕记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，内酯酶来自镰孢属；〔3〕产生内酯酶的转化子，其特征是，导入的DNA是编码具有序列表编号9中的第1～第380个氨基酸的氨基酸序列的内酯酶的DNA，或编码上述序列一部分序列与信号肽区域的DNA；〔4〕上述〔3〕记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，信号肽区域是序列表编号9中的第-20～第-1个氨基酸所组成的氨基酸序列或上述序列的一部分序列，或是Alp信号肽区域；〔5〕具有D-泛解酸内酯水解活性的重组内酯酶的制造方法，其特征是，培养上述〔1〕～〔4〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子，使之产生重组内酯酶，并得到重组内酯酶；和〔6〕制造通式(II)或通式(IV)所示的光学活性的γ-内酯衍生物或其盐的方法，其特征是，使用通式(I)所表示的化合物或其盐接触选自上述〔1〕～〔4〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子的培养物、其细胞、细胞处理物或固定化菌体、从该转化子得到的重组内酯酶和固定化的重组内酯酶。通式(I) (R表示羟基、氨基，R1和R2相同或不同，各自独立表示氢或低级烷基)通式(II) (R、R1和R2分别和上述相同)通式(IV) (R、R1和R2分别和上述相同)。在其他实施方案中，本专利技术提供〔7〕产生内酯酶的转化子，其特征是，其中导入了编码具有D-泛解酸内酯水解酶活性的内酯酶和信号肽区域的DNA或导入了插有该DNA的载体；〔8〕上述〔7〕记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，其中的载体具有1个或多个丝状菌的增强子碱基序列；〔9〕上述〔1〕～〔4〕、〔7〕和〔8〕中记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，其中的载体在于丝状菌中具有功能的启动子区域导入1个或多个丝状菌的增强子碱基序列；〔10〕上述〔1〕～〔4〕和〔7〕～〔9〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，其中的载体在于丝状菌中具有功能的启动子区域导入了1个或多个米曲霉的α-葡糖苷酶(agdA)启动子上的增强子序列；〔11〕上述〔9〕或〔10〕记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，其启动子区域为来自丝状菌的水解酶基因或糖分解系统酶基因的启动子区域；〔12〕上述〔9〕～〔11〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，其启动子区域为源于米曲霉的α-葡糖苷酶(agdA)基因的启动子区域，或含有其部分序列的启动子区域；〔13〕上述〔7〕～〔12〕中任一个记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，载体是含有适于对宿主丝状菌的转化子进行选择的标记(marker)基因、含有在大肠杆菌中进行复制的DNA区域的用于在丝状菌中表达多肽的质粒；〔14〕上述〔13〕中记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，标记基因源自丝状菌的硝酸还原酶基因、鸟氨酸氨基甲酰转移酶基因、色氨酸合成酶基因或乙酰氨酶基因；〔15〕上述〔13〕或〔14〕记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，标记基因为曲霉菌属的硝酸还原酶基因；〔16〕上述〔13〕记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，终止子为源于米曲霉的α-葡糖苷酶基因的终止子或含有其部分序列的终止子；〔17〕上述〔7〕记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，载体含有表达镰孢属丝状菌所产生的碱性蛋白酶(Alp)的启动子区域；〔18〕上述〔1〕或〔7〕记载的产生内酯酶的转化子，其特征是，信号肽区域是分泌该Alp的信号肽序列区域或该内酯酶的信号肽序列区域；〔19〕产生内酯酶的转化子，其特征是，其中导入了含有下述序列的DNA(a)编码全长的具有D-泛解酸内酯水解酶活性的全长内酯酶的DNA序列和(b)编码该内酯本文档来自技高网...
【技术保护点】
产生内酯酶的转化子，其特征是，其中导入了编码具有Ｄ－泛解酸内酯水解酶活性的内酯酶和信号肽区域的ＤＮＡ。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：清水昌，片冈道彦，坂本惠司，
申请(专利权)人：第一精密化学株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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