用6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)来增加异戊二烯及其他产物的产量的组合物和方法技术

本文提供用于增大异戊二烯产量的改良组合物和方法。本文还提供用于增大能够具有生物活性的异源多肽产量的改良组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及用于增加大肠杆菌(E. coli)中生物化学物质的产量的改良组合物和方法、以及用于增加大肠杆菌中异戊二烯产量的改良组合物和方法。
技术介绍
异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是广泛应用的重要有机化合物。例如，在合成 多种化学组合物和聚合物时，异戊二烯被用作中间材料或原料。异戊二烯还是通过许多植物和动物天然合成的重要生物材料。当异戊二烯的立构规整聚合在二十世纪六十年代早期进入市场时，异戊二烯成为用于合成顺式-1，4-聚丁二烯的重要单体。通过这种立构规整聚合所制备的顺式-1，4-聚异戊二烯的结构和性质类似于天然橡胶。尽管它与天然橡胶不完全相同，但它在许多应用中可用作天然橡胶的替代品。例如，合成的顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶被广泛用于制备车辆轮胎和其他橡胶产品。对合成的顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶的该需求消耗了大部分在世界市场上可获得的异戊二烯。剩余的异戊二烯被用于制备其他合成橡胶、嵌段共聚物和其他化学产品。例如，异戊二烯被用于制备丁二烯-异戊二烯橡胶、苯乙烯-异戊二烯共聚物橡胶、苯乙烯-异戊二烯-丁二烯橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物和苯乙烯-异戊二烯嵌段共聚物。在工业应用中使用的异戊二烯通常作为石油或石脑油热裂解的副产物而产生，或以其他方式从石化流体中提取。这是相对昂贵的能源密集型过程。世界范围内对基于石油化工的产品的需求持续增加，与此同时预计长期内对异戊二烯的消耗将上升到高得多的水平，并且在任何情况下它的可获得性受到限制。存在未来从基于石油化工来源的异戊二烯供应将不足以满足计划的需求、且其价格将上升到前所未有的水平的担忧。因此，存在从环境友好的、低成本、可再生资源中获得异戊二烯来源的需求。本文所述的改良方法和组合物即提供异戊二烯的这种来源，其能够以低成本从可再生资源中获得。最近在由可再生来源产生异戊二烯方面取得了一些进展(参见例如国际专利申请公开No. WO 2009/076676A2)。这些产生异戊二烯的方法在速率、滴度和纯度上可能足以符合对一个正常的商业方法的要求，然而需要改良方法以降低与源于生物来源的异戊二烯的生产相关的操作成本并增大异戊二烯的产量，例如用于增大异戊二烯和本文所提供的能够具有生物活性的其他异源多肽的产量的改良组合物和方法。所有专利、专利申请、文档、核苷酸和蛋白质序列数据库记录号、以及本文中引用的文章均全文以引用方式并入本文中。
技术实现思路
本文公开用于增大异戊二烯产量的改良组合物和方法。本文还提供用于增大能够具有生物活性的异源多肽产量的改良组合物和方法。本专利技术部分地基于观察到将6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)染色体整合到缺乏编码PGL多肽的核酸的大肠杆菌菌株内会增大诸如异戊二烯或甲羟戊酸的不同种类产物的产量。因此，在一个方面，本专利技术提供能够产生异戊二烯的大肠杆菌菌株的重组细胞或其子代，该细胞包含(a)编码PGL多肽的异源核酸的一个或多个拷贝，其中所述核酸整合在大肠杆菌染色体中；以及(b)编码异戊二烯合酶的一种或多种异源核酸；其中在所述整合之前，所述大肠杆菌细胞不包含编码PGL多肽的核酸，并且其中所得的重组细胞产生的异戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同细胞的滴度。在本文的任何方面，编码钥摄取多肽的异源核酸的一个或多个拷贝被额外整合在所述大肠杆菌染色体中。在本文的任何方面，所述钥摄取多肽选自modF、modE、modA、modB和modC。在本文的任何方面，编码半乳糖代谢多肽的异源核酸的一个或多个拷贝被额外整 合在所述大肠杆菌染色体中。在本文的任何方面，所述半乳糖代谢多肽选自galM、galK、gall^P galE。在本文的任何方面，编码半乳糖代谢多肽的异源核酸的一个或多个拷贝和编码钥摄取多肽的异源核酸的一个或多个拷贝被额外整合在所述大肠杆菌染色体中。在本文的任何方面，(a)所述PGL多肽是大肠杆菌PGL多肽；(b)所述钥摄取多肽选自m0dF、m0dE、modA、modB和modC ;并且(C)所述半乳糖代谢多肽选自galM、galK、galT和galE。在本文的任何方面，编码所述PGL多肽、半乳糖代谢多肽和钥摄取多肽的核酸是如图20所示的17，257碱基对片段的一部分。在本文的任何方面，所述重组细胞产生异戊二烯的比产率高于不包含(a)和(b)的相同细胞。在本文的任何方面，所述重组细胞具有至少为15mg/0D/h的比产率。在本文的任何方面，编码PGL多肽、钥摄取多肽和/或半乳糖代谢多肽的核酸来自大肠杆菌菌株K12MG1655或所述大肠杆菌菌株K12MG1655的衍生物。在本文的任何方面，所述细胞属于大肠杆菌菌株B。在本文的任何方面，所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21。在本文的任何方面，所述细胞属于大肠杆菌菌株BL21 (DE3)。在本文的任何方面，所述重组大肠杆菌细胞还包含(C)编码甲羟戊酸(MVA)途径上游的多肽和/或MVA途径下游的多肽的异源核酸。在本文的任何方面，所述重组大肠杆菌细胞还包含(d)编码甲羟戊酸(MVA)途径上游的多肽和/或MVA途径下游的多肽的异源核酸。在本文的任何方面，所述MVA途径上游的多肽选自(i)乙酰乙酰基辅酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii) 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽。在本文的任何方面，所述MVA途径下游的多肽选自(i)甲羟戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；(iii) 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD);以及(iv)异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)。在本文的任何方面，(a)所述PGL多肽是大肠杆菌PGL多肽；(b)所述钥摄取多肽选自modF、modE、modA、modB和modC ;并且(c)所述半乳糖代谢多肽选自galM、galK、galT和galE。在本文的任何方面，所述异戍二烯合酶多肽来自银白杨(Populus alba)。本专利技术还提供产生异戊二烯的方法，所述方法包括(a)在适于产生异戊二烯的培养条件下培养包含本文所述任何重组细胞的组合物，以及(b)产生异戊二烯。在一些方面，所述方法还包括回收所述异戊二烯。在其他方面，所述重组细胞具有大于约15mg/0D/h的异戊二烯比产率。本专利技术还提供产生甲羟戊酸的方法，所述方法包括(a)在适于产生甲羟戊酸的培养条件下培养包含权利要求15所述重组细胞的组合物，以及(b)产生甲羟戊酸。在一些方面，所述方法还包括回收所述甲羟戊酸。本专利技术还提供制备本文所述任何重组细胞的方法，包括(a)将编码PGL多肽的异源核酸转导至大肠杆菌细胞内，其中在所述整合之前，所述大肠杆菌细胞不包含编码PGL多肽的核酸；(b)使所述编码PGL多肽的核酸整合在大肠杆菌染色体中；以及(c)将编码异戊二烯合酶的一种或多种异源核酸引入大肠杆菌细胞内。本专利技术还提供包含本文所述任何重组细胞的组合物。 在其他方面，本文提供不编码PGL多肽的大肠杆菌菌株细胞，其中所述大肠杆菌细胞包含使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的异源基因的一个或多个拷贝和编码能够具有生物活性的异源多肽的核酸，并且其中当将所述细胞培养在基本培养基中时，所述细胞产生能够具有生物活性的异源多肽的比产率大于缺乏使用一种或多种相关的表达控制序列编码PGL多肽的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：Z·Q·贝克，M·A·塞尔温，A·T·尼尔森，C·M·派瑞斯，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，固特异轮胎和橡胶公司，
类型：
国别省市：