糖链天冬酰胺衍生物的制造方法技术

糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其为由脱脂卵黄制造糖链天冬酰胺衍生物的方法，其包括：（ａ）用蛋白质分解酶由脱脂卵黄制造糖链肽混合物的工序；（ｂ）用肽分解酶由糖链肽混合物制造糖链天冬酰胺混合物的工序；（ｃ）将脂溶性的保护基导入糖链天冬酰胺混合物中的糖链天冬酰胺，制造糖链天冬酰胺衍生物混合物的工序，（ｄ）将糖链天冬酰胺衍生物混合物供给色谱，将各糖链天冬酰胺衍生物分离的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及。
技术介绍
近年来，作为继核酸(DNA)、蛋白质之后的第三个链状生命分子，糖链分子引人注目。人体是由约60兆个细胞构成的一大细胞社会，所有的细胞表面都被糖链分子覆盖。例如，ABO式血型就是由细胞表面糖链的不同决定的。糖链具有参与细胞间识别和相互作用的功能，成为构成细胞社会的要素。细胞社会的紊乱与癌、慢性疾病、感染病、老化等有关。例如，已知细胞如果癌化，就会引起糖链的结构变化。另外也知道霍乱弧菌或流感病毒等通过识别、结合某一特定糖链，侵入、感染细胞。糖链由于单糖的序列、结合样式以及部位、链长度以及分支样式、整体的高次结构等的多样性，所以与核酸或蛋白质的结构相比，是非常复杂的结构。因此，来自其结构的生物学信息与核酸和蛋白质相比，多种多样。现状是虽然人们认识到糖链研究的重要性，但由于其结构复杂和多样性，与核酸和蛋白质相比，研究进展缓慢。另一方面，已知从脱脂卵黄可以得到糖链天冬酰胺(例如参照专利文献1)。根据专利文献1，通过在脱脂卵黄中添加杏仁或杏种子，可以比以往更大量地获得糖链天冬酰胺。但是，用这种方法得到的糖链天冬酰胺的纯度为95％或92％，不能分离出纯粹的糖链天冬酰胺。此外，从100kg脱脂卵黄中获得的双唾液酸低聚糖(11糖双唾液酸低聚糖)的收量也只为29.5g或27.2g。此外，还已知由从鸡蛋的可溶级分中提取的糖肽(SGP唾液酸糖肽)获得糖链天冬酰胺。该SGP是在由11个糖残基构成的复合型糖链的还原末端结合了由氨基酸6残基构成的肽链的天冬酰胺残基的化合物。但是，SGP根据例如濑古等的方法，从1个鸡蛋黄中只能得到约8mg。国际公开W096/02255号公报(权利要求8和权利要求10)本专利技术的目的在于提供，与以往相比能非常容易且大量地获得在医药品开发等领域中有用的各种分离的糖链天冬酰胺衍生物。
技术实现思路
本专利技术涉及以下专利技术。1.，其为由脱脂卵黄制造糖链天冬酰胺衍生物的方法，其包括(a)用蛋白质分解酶由脱脂卵黄制造糖链肽混合物的工序；(b)用肽分解酶由糖链肽混合物制造糖链天冬酰胺混合物的工序；(c)将脂溶性的保护基导入糖链天冬酰胺混合物中的糖链天冬酰胺，制造糖链天冬酰胺衍生物混合物的工序，(d)将糖链天冬酰胺衍生物混合物供给色谱，将各糖链天冬酰胺衍生物分离的工序。2.上述的，其中，脱脂卵黄是通过用有机溶剂对鸟类的卵的卵黄进行脱脂处理而获得的。3.上述的，其中，糖链天冬酰胺衍生物是11～5糖链天冬酰胺衍生物。4.上述的，其中，脂溶性的保护基为含有碳酸酯的基团、酰基、烯丙基、Fmoc基或Boc基。5.上述的，其中，预先将(b)中得到的糖链天冬酰胺混合物中含有的糖链天冬酰胺水解，将一部分糖残基切断。6.上述的，其中，预先将(c)中得到的糖链天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖链天冬酰胺衍生物水解，将一部分糖残基切断。本专利技术的的特征在于用蛋白质分解酶由从卵黄例如鸟类卵黄得到的脱脂卵黄制得糖链肽混合物，然后用肽分解酶得到糖链天冬酰胺的混合物，其次将脂溶性的保护基导入(结合)该混合物中含有的该糖链天冬酰胺，得到糖链天冬酰胺衍生物的混合物，然后将该混合物分离为各糖链天冬酰胺衍生物。在本说明书中，“糖链天冬酰胺”是指结合了天冬酰胺状态的糖链。此外“天冬酰胺结合型糖链”指的是存在于还原末端的N-乙酰葡糖胺通过N-糖苷键与蛋白质多肽中天冬酰胺(Asn)的酸氨基连接的糖链组，以Man(β1-4)GlcNac(β1-4)GlcNac作为母核的糖链组。所谓“糖链天冬酰胺衍生物”指的是在天冬酰胺残基上结合了脂溶性保护基状态的糖链天冬酰胺。此外，在化合物的结构式中，「AcHN」表示乙酰胺基。本专利技术的，具体地说，包括(a)用蛋白质分解酶由脱脂卵黄制造糖链肽混合物的工序；和(b)用肽分解酶由糖链肽混合物制造糖链天冬酰胺混合物的工序；和(c)将脂溶性的保护基导入糖链天冬酰胺混合物中的糖链天冬酰胺，制造糖链天冬酰胺衍生物混合物的工序；和(d)将糖链天冬酰胺衍生物混合物供给色谱，将各糖链天冬酰胺衍生物分离的工序。以下，对本专利技术的由脱脂卵黄制造进行具体说明。本专利技术中使用的脱脂卵黄并无特别限定，可以是例如用有机溶剂对鸟类的卵的卵黄(优选鸡、鹌鹑、家鸭、野鸭、鸽子等的卵黄，特别优选卵黄内含有的人型糖链天冬酰胺，从人型2分支糖链天冬酰胺的量出发，特别优选鸡)进行脱脂处理的卵黄。此时，作为有机溶剂，优选甲醇、乙醇、二乙醚等。作为(a)工序，是用蛋白质分解酶将上述脱脂卵黄的蛋白质切断，得到脱脂卵黄所含的糖链肽(糖链天冬酰胺肽)的混合物。此时，作为使用的蛋白质分解酶，可以使用例如プロナ一ゼ(和光纯药社制)、オリエンタ一ゼ(HBI社制)等一般的蛋白质分解酶。此外，优选使用公知的方法，例如使用凝胶过滤柱、离子交换柱等的各种色谱以及使用高速液相色谱(HPLC)的精制法从糖链肽的混合物中将糖链肽以外的成分除去。作为(b)工序，其为用肽分解酶将(a)工序得到的糖链肽的混合物的肽进行分解，得到糖链肽所含有的糖链天冬酰胺的混合物。此时，作为所使用的肽分解酶，可以使用例如アクチナ-ゼ等一般的肽分解酶。此外，优选使用公知的方法，例如使用凝胶过滤柱、离子交换柱等的各种色谱以及使用高速液相色谱(HPLC)的精制法从糖链天冬酰胺的混合物中将糖链天冬酰胺以外的成分除去。此外，从高效地获得具有所希望的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物的观点出发，优选进一步将该混合物中含有的糖链天冬酰胺水解，预先将一部分糖残基切断。作为水解的方法，包括使用酸的方法或使用酶的方法等。作为上述酸并无特别限定，可以使用例如盐酸、硫酸、硝酸、三氟乙酸等无机酸和有机酸，阳离子交换树脂，不溶性的固体试剂(二氧化硅凝胶等)等。此外，作为酶，优选糖水解酶，也可以使用内切型、外切型任何一种的反应样式的酶。作为该酶，并无特别限定，如果具有该活性，可以是市售的酶、新分离的酶、基因工学上创造的酶。酶反应可以按照公知的条件进行，此时，可以用薄层色谱跟踪反应的进行，在最多地得到化合物时，适当地停止反应。作为(c)工序，是使用含有(b)工序得到的糖链天冬酰胺的混合物，将脂溶性的保护基导入其含有的糖链天冬酰胺中。作为该保护基，并无特别限定，可以使用例如9-芴基甲氧羰(Fmoc)基、叔丁氧羰(Boc)基、烯丙氧基碳酸酯(Alloc)基等含碳酸酯的基团、乙酰(Ac)基等酰基、烯丙基、苄基等保护基。考虑到合成的效率和以下工序的分离精制的效率，优选9-芴基甲氧羰(Fmoc)基、叔丁氧羰(Boc)基、烯丙氧基碳酸酯基等含碳酸酯的基团、乙酰基等酰基。此外，从可以直接将得到的糖链天冬酰胺衍生物用于所希望的糖肽的合成的观点出发，作为该保护基，优选广泛用于肽合成的Fmoc基或Boc基，其中Fmoc基当糖链中存在在唾液酸等比较酸性条件下不稳定的糖时特别有效，因此更优选。另外，保护基的导入可以按照公知的方法(例如参照Protecting groups in Organic Chemistry，JohnWiley & Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)进行。例如，使用Fmoc基时，通过向含有糖链天冬酰胺的混合物中加适量丙酮或DMF后，再加入9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺碳酸酯和碳酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其为由脱脂卵黄制造糖链天冬酰胺衍生物的方法，其包括：（ａ）用蛋白质分解酶由脱脂卵黄制造糖链肽混合物的工序；（ｂ）用肽分解酶由糖链肽混合物制造糖链天冬酰胺混合物的工序；（ｃ）将脂溶性的保护基导入糖链天冬酰胺混合物中的糖链天冬酰胺，制造糖链天冬酰胺衍生物混合物的工序，（ｄ）将糖链天冬酰胺衍生物混合物供给色谱，将各糖链天冬酰胺衍生物分离的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：深江一博，
申请(专利权)人：大塚化学株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]