识别β-淀粉样肽的人源化抗体制造技术

本发明专利技术提供了改进的试剂和方法，用于治疗与病人脑中的Ａβ淀粉样沉积有关的疾病。优选的试剂包括抗体，例如人源化抗体。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关的申请本申请要求以前在先提交的临时专利申请U.S.No.60/474,654(2003年5月30日提交)的优先权，该申请的专利技术名称是“识别β-淀粉样肽的人源化抗体”。上面引用的申请的全部内容在此引为参考。
技术介绍
阿茨海默氏病(AD)是一种进行性疾病，可以引起老年痴呆。参见Selkoe，TINS 16403(1993)；Hardy等，WO 92/13069；Selkoe，J.Neuropathol.Exp.Neurol.53438(1994)；Duff等，Nature 373476(1995)；Games等，Nature 373523(1995)。从广义来说，这种疾病分为两类在老龄(65岁以上)发作的晚期发病型和老年期以前，即35岁到60岁之间就完全发展的早期发病型。在这两种类型的疾病中，病理学是相同的，但是在较早年龄开始发病的情况下，异常会趋于更加严重和广泛。该病的特征是在脑中至少有两种类型的损害，神经纤维缠结和老年斑。神经纤维缠结是与τ蛋白相关的微管的细胞内沉积，该蛋白由两根成对的互相缠绕的纤丝组成。老年斑(即淀粉样斑)是被打乱的神经纤维网的区域，它覆盖着位于中心的细胞外淀粉样沉积物，可达150μm，在脑组织切片的显微镜分析时可以看到。淀粉样斑在脑中的积累也与Down氏综合症和其它认知紊乱有关。斑的基本组成成分是一种被称为Aβ或β-淀粉样肽的肽。Aβ肽是一种被称为淀粉样前体蛋白(APP)的较大的跨膜糖蛋白中含有39-43个氨基酸的内部片段，大小约为4-kDa。作为APP被不同的分泌酶进行蛋白水解加工的结果，最初发现的Aβ有两种形式，短的形式长度为40个氨基酸，而长的形式长度为42-43个氨基酸。在Aβ的羧基端发现了APP的疏水跨膜结构域的一部分，这可解释Aβ，特别是长形式的Aβ在斑中聚集的能力。淀粉样斑在脑中的积累最终导致神经元细胞的死亡。与这种类型的神经元退化有关的身体症状是阿茨海默氏病的特点。APP蛋白中的几个突变已经与阿茨海默氏病的出现相关联。参见例如Goate等，Nature 349704(1991)(717位的缬氨酸变为异亮氨酸)；Chartier Harlan等，Nature 353844(1991)(717位的缬氨酸变为甘氨酸)；Murrell等，Science 25497(1991)(717位的缬氨酸变为苯丙氨酸)；Mullan等，Nature Genet.1345(1992)(双突变，595位的赖氨酸和596位的甲硫氨酸变为595位的天冬酰胺和596位的亮氨酸)。这些突变被认为通过增加或改变从APP到Aβ的加工，特别是从APP到增量的长形式的Aβ(即Aβ1-42和Aβ1-43)的加工而引起阿茨海默氏病。其它基因，例如早老素(presenilin)基因PS1和PS2的突变，被认为间接地影响了APP的加工，从而产生了增量的长形式Aβ(参见Hardy，TINS20154(1997))。小鼠模型已经被成功地用来确定淀粉样斑在阿茨海默氏病中的重要性(Games等，同上；Johnson-Wood等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA941550(1997))。具体来说，当用长形式的Aβ注射PDAPP转基因小鼠(该小鼠表达突变形式的人APP，并在幼龄时就发展出阿茨海默氏病)时，它们表现出阿茨海默氏病发展的减慢和针对Aβ肽抗体滴度的增加(Schenk等，Nature 400173(1999))。上面讨论的观察表明Aβ，特别是它的长形式，是阿茨海默氏病的一个病因。因此，存在着对治疗阿茨海默氏病的新疗法和药剂，特别是能够在生理(例如非毒性)剂量下实现治疗效果的疗法和药剂的需求。专利技术简述本专利技术的特征在于新的免疫药剂，具体来说是预防和治疗生成淀粉样疾病(例如阿茨海默氏病)的治疗性抗体药剂。本专利技术至少部分地基于单克隆抗体12A11的识别和表征，该抗体与Aβ肽特异性结合，有效地减少了与生成淀粉样紊乱有关的斑负荷。对该抗体的结构和功能的分析导致设计了各种人源化抗体用于预防和/或治疗。具体来说，本专利技术的特征在于对该抗体的可变区进行人源化，从而提供了所述抗体的人源化免疫球蛋白或抗体链、完整的人源化免疫球蛋白或抗体以及功能性免疫球蛋白或抗体片段，特别是抗原结合片段。含有所述单克隆抗体的互补决定区(CDR)的多肽也被公开了，适合于编码该多肽的多核苷酸试剂、载体和宿主细胞也被公开。还公开了生成淀粉样疾病或紊乱(例如阿茨海默氏病)的治疗方法，以及其中使用的药物组合物和试剂盒。本专利技术的特征为在所述单克隆抗体中对于适当的免疫功能来说是重要的残基的鉴定方法，以及在设计具有改善的结合亲和性和/或减少的免疫原性的人源化抗体中在用作治疗药剂时适合取代的残基的鉴定方法。本专利技术的特征还在于具有改变的效应子功能的抗体及其治疗应用。附图简述附图说明图1图示实验结果，所述实验检查各种不同的抗体，包括12A11，在离体吞噬分析中对清除Aβ斑的效果。图2图示实验结果，所述实验检查各种不同的抗体，包括12A11，对减少总Aβ水平的效果。长方块代表中值，而水平虚线显示对照水平。图2B图示实验结果，所述实验分析各种不同的抗体，包括12A11，对减少神经性营养不良的效果。长方块代表中值，而水平虚线显示对照水平。数据以单个动物示出，并表示成相对于对照的平均值(设定为100％)神经性营养不良的百分比。图3A描述了包括鼠12A11VL链序列的DNA序列，以及推论的VL链的氨基酸序列(分别为SEQ ID NOs5和2)。成熟VL链以实体黑色长方块显示。CDRs以空心长方块显示。图3B描述了包括鼠12A11VH链序列的DNA序列，以及推论的VH链的氨基酸序列(分别为SEQID NOs6和3)。成熟VH链以实体黑色长方块显示。CDRs以空心长方块显示。DNA序列包括克隆位点和Kozak序列(编码序列的上游)和剪接和克隆序列(下游)。图4图示实验的ELISA结果，所述实验测量嵌合12A11，嵌合和人源化3D6，和嵌合和人源化12B4与Aβ1-42结合。图5A描述了鼠(或嵌合)12A11(SEQ ID NO2)，人源化12A11(成熟肽，SEQ ID NO7)，GenBank BAC01733(SEQ ID NO8)和种系A19(X63397，SEQ ID NO9)抗体轻链的氨基酸序列的比对。CDR区以盒框表示。装配残基以下划线表示。编号从第1个甲硫氨酸开始，而非Kabat编号。图5B描述了鼠(或嵌合)12A11(SEQ ID NO4)，人源化12A11(版本1)(成熟肽，SEQ ID NO10)，GenBank AAA69734(SEQ IDNO11)和种系GenBank 567123抗体(SEQ ID NO12)重链的氨基酸序列的比对。装配残基以下划线表示，典型残基以实体填充，而微调残基以虚线填充。编号从第1个甲硫氨酸开始，而非Kabat编号。图6A-B描述人源化12A11v1(SEQ ID NO10)，v2(SEQ IDNO13)，v2.1(SEQ ID NO14)，v3(SEQ ID NO15)，v4.1(SEQ IDNO16)，v4.2(SEQ ID NO17)，v4.3(SEQ ID NO18)，v4.4(SEQ IDNO19)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源化免疫球蛋白轻链，含有（ｉ）来自ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２所显示的１２Ａ１１免疫球蛋白轻链可变区序列的可变区互补决定区（ＣＤＲｓ），和（ｉｉ）来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变框架区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：古里奇巴锡，乔斯W萨尔达尼亚，弗雷德里克巴尔德，
申请(专利权)人：神经实验室有限公司，惠氏公司，
类型：发明
国别省市：BM[百慕大]