在缺乏酶的黑曲霉突变体中生产生物物质的方法技术

本发明专利技术涉及生产异源生物物质的方法，包括：（ａ）在适于生产异源生物物质的培养基中培养亲本黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　　ｎｉｇｅｒ）菌株的突变株，其中（ｉ）该突变菌株包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括ｇｌａＡ和至少一个选自ａｓａ、ａｍｙＡ、ａｍｙＢ、ｐｒｔＴ或ｏａｈ的基因变体的一种或多种第二核苷酸序列，和（ｉｉ）当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α－淀粉酶、中性α－淀粉酶Ａ、或中性α－淀粉酶Ｂ、蛋白酶、或草酸水解酶的酶的生产；以及（ｂ）从培养基回收异源的生物物质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
专利
本专利技术涉及在缺乏酶的黑曲霉(Aspergillus niger)突变菌株中生产异源生物物质的方法、获得缺乏酶的黑曲霉突变菌株的方法、以及缺乏酶的黑曲霉突变菌株。相关技术的说明黑曲霉分泌大量的葡糖淀粉酶。然而，具有蛋白表达和分泌增加的所需要性状的黑曲霉宿主未必具有用于成功发酵的最合乎需要的特性。由于需要在回收和纯化令人感兴趣的生物物质期间移出分泌的多重酶或可能伴随生物物质共同纯化该酶，因此发酵未必是最佳的。Boel等人，1984，EMBO J.31097-1102，1581-1585，公开了对黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)基因的克隆。Fowler等人，1990，Curr.Genet.18537-545公开了黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)基因的缺失。Korman等人，1990，Curr.Genet.17203-217公开了来自黑曲霉泡盛曲霉(awamori)变体的2个α-淀粉酶基因(amyA和amyB)的克隆、表征鉴定和表达。美国专利号5,252,726公开了来自黑曲霉的2个全长中性α-淀粉酶基因的克隆。美国专利号5,252,726公开了来自黑曲霉的部分酸稳定的α-淀粉酶基因(asa)的克隆。Pedersen等人，2000，Metabolic Engineering 234-41，和WO 00/50576公开了在生产葡糖淀粉酶的黑曲霉菌株中编码草酰乙酸水解酶(EC 3.7.1.1)的草酰乙酸水解酶(oah)基因的断裂，其中所得到的菌株不能生产草酸。WO 01/68864公开了prtT-断裂的黑曲霉菌株缺乏蛋白酶，表明宿主菌株中prtT表达的缺失可能导致对蛋白水解敏感的可回收蛋白的水平增加。本专利技术的目的是提供改善的黑曲霉宿主，其兼备表达商品化的大量生物物质的能力而缺乏生产可能使令人感兴趣的生物物质的回收和下游加工过程复杂化的酶。专利技术概述本专利技术涉及生产异源生物物质的方法，包括(a)在适于生产异源生物物质的培养基中培养亲本黑曲霉菌株的突变株，其中(i)该突变菌株包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因变体的一种或多种第二核苷酸序列，以及(ii)当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生产；以及(b)从培养基回收异源的生物物质。本专利技术也涉及缺乏酶的黑曲霉突变菌株和生产缺乏酶的黑曲霉突变菌株的方法。附图简述附图说明图1显示pJRoy10的限制图谱。图2显示pMBin01+的限制图谱。图3显示pJRoy17的限制图谱。图4.显示pSMO127的限制图谱。图5.显示pMBin05的限制图谱。图6.显示pMBin04+的限制图谱。图7显示pMBin09的限制图谱。图8显示pMBin10的限制图谱。图9显示pMBin02的限制图谱。图10显示pMBin03的限制图谱。图11显示pMBin08的限制图谱。图12显示prtT缺失对蛋白酶活性的影响。图13显示prtT缺失对南极洲假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B活性的影响。图14显示黑曲霉普通宿主菌株MBin114、MBin118和MBin120中Scytalidium thermophilum过氧化氢酶生产的比较。专利技术详述本专利技术涉及生产异源生物物质的方法，包括(a)在适于生产异源生物物质的培养基中培养亲本黑曲霉菌株的突变株，其中(i)该突变菌株包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因变体(modification)的一种或多种第二核苷酸序列，和(ii)当在相同条件下培养时，与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生产；以及(b)从培养基回收异源的生物物质。本专利技术的优点是消除或减少异源生物物质的黑曲霉发酵液体培养基简单化下游过程中的葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶。术语″淀粉葡萄糖苷酶″在此定义为糊精6-α-D-葡聚糖水解酶活性，其催化1，4-连接的α-D-葡萄糖残基和末端1，4-连接的α-D-葡萄糖残基链中分支点的1，6-α-D-糖苷连接的内水解。为了本专利技术的目的，根据Fagershom和Kalkkinen，1995，Biotechnol.Appl.Biochem.21223-231描述的方法确定葡糖淀粉酶活性，其中利用葡萄糖氧化酶测定试剂盒(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)在pH4，25℃测量由葡糖淀粉酶从0.1M麦芽三糖产生的葡萄糖。1个单位的葡糖淀粉酶活性定义为在25℃，pH4每分钟产生1.0μmol的葡萄糖。术语“α-淀粉酶活性”在此定义为1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶活性，其催化具有3个以上α-1，4-连接的葡萄糖单元的多糖在存在水时内水解为麦芽低聚糖。术语″酸稳定的α-淀粉酶活性″在此定义为在酸性pH范围中具有最佳活性的α-淀粉酶活性。为了本专利技术，利用4，6-亚乙基(G7)-p-硝基苯基(G1)-α-D-maltoheptaside作为底物，利用Sigma Chemical Co.试剂盒577在pH4.0测定酸稳定的α-淀粉酶活性。术语″中性α-淀粉酶活性″在此定义为在中性pH范围中具有最佳活性的α-淀粉酶活性。为了本专利技术，利用4，6-亚乙基(G7)-p-硝基苯基(G1)-α-D-maltoheptaside作为底物，利用Sigma Chemical Co.试剂盒577，在pH7.0测定中性α-淀粉酶活性。术语″草酸水解酶″在此定义为在存在水时催化草酰乙酸转化为草酸和乙酸酯的酶活性。分类该酶为属于EC 3.7.1.1。为了本专利技术，根据在本文实施例小节中描述的方法测定草酰乙酸水解酶活性。1个单位的草酰乙酸水解酶活性定义为在30℃，pH7.5每分钟产生1.0μmol的草酸。术语“变体”在此定义为在基因或为其转录或翻译所需要的调控元件中导入、取代、或除去一个或多个核苷酸，以及基因断裂、基因转换、基因缺失、或glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT、和oah的基因的随机或特异的诱变。glaA基因和asa、amyA、amyB、prtT、和/或oah基因的缺失可以是部分或全部的。变体导致glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT、和oah的基因的表达的降低或消除。在优选的方面，变体导致glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT、和oah的基因的失活。在另一个优选的方面，变体导致glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT、和oah的基因的表达降低。在另一个优选的方面，变体导致glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT、或oah的基因的表达降低、消除、或其组合。在优选的方面，突变包括glaA和asa的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA和amyA的改变。在另一个优选的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产异源生物物质的方法，包括：（ａ）在适于生产异源生物物质的培养基中培养亲本黑曲霉菌株的突变体，其中（ｉ）该突变菌株包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括ｇｌａＡ和至少一个选自ａｓａ、ａｍｙＡ、ａｍｙＢ、ｐｒｔＴ或ｏａｈ的基 因变体的一种或多种第二核苷酸序列，以及（ｉｉ）当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α－淀粉酶、中性α－淀粉酶Ａ、或中性α－淀粉酶Ｂ、蛋白酶、或草酸水解酶的酶的生产；以及（ｂ）从培养 基回收异源的生物物质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：玛丽亚康奈利，霍华德布罗迪，
申请(专利权)人：诺维信股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]