β-淀粉样肽结合蛋白及其编码聚核苷酸制造技术

本发明专利技术提供结合人β－淀粉样肽的新蛋白质，编码这类蛋白质的聚核苷酸，以及生产这类蛋白质的方法。此外还提供利用本发明专利技术聚核苷酸和多肽的诊断、治疗和筛选方法。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的聚核苷酸及其编码的蛋白质，还涉及所述聚核苷酸及蛋白质在治疗、预防和研究方面的用途。具体地说，本专利技术所涉及的聚核苷酸所编码的蛋白质结合β-淀粉样肽，这种肽是与早老性痴呆症(早老性痴呆病)有关的淀粉样蛋白沉积物的主要成份之一。
技术介绍
早老性痴呆病(AD)是一种进行性老年痴呆症，以一系列脑结构异常为特征。中枢神经系统(CNS)许多区域内的神经元发生功能障碍或死亡，导致突触输入的交迭(alterations)。这些脆弱的神经元细胞体和邻近的树突含有成对的螺旋状长丝构成的神经纤维缠绕，其中的主要成份是磷酸化的微管结合蛋白，又称tau蛋白。该病的特征之一是脑内含淀粉样蛋白沉淀的积累，称为衰老(神经)斑。淀粉样蛋白斑的主要成份是β-淀粉样肽(后文以“BAP”表示，在文献中又称Aβ、βAP等)，它在AD的病程中形成致密的聚集体。BAP是一种39-43氨基酸的肽，由淀粉样前体蛋白(后文以“APP”表示)经蛋白酶剪切而得，具有APP的跨膜域和鲁米诺(luminal)/胞外域。包含42个氨基酸的BAP肽(BAP42)被认为可能是人体内更毒的聚集体。APP以数种含BAP的同种型形式出现。主要形式包含695、751和770个氨基酸，后两种APP含有的一个结构域在结构及功能具有与Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂的同源性。在正常个体内，BAP不积累，而且被从循环体液中迅速清除。但是，这种肽会在营养不良的树突和轴突表面、小微神经胶质细胞和活性星形细胞上形成斑。神经斑内BAP的聚集和沉积被认为可能是AD的早期活动之一。研究导致BAP表达及其后果以及它们各自在AD中的作用是神经科学研究的一个主要焦点。尤其是，结合BAP的蛋白的发现对于促进理解该疾病的病理和可能引入新的治疗目标是关键性的。在本专利技术之前，还没有鉴定到结合人BAP以及可能涉及BAP在AD中作用的蛋白质及其片段。专利技术概述本专利技术提供了一种新的分离的聚核苷酸，它编码选择性结合β-淀粉样肽(BAP)氨基酸序列的基因产物。在实施例之一中，本专利技术提供了一种组合物，其中所含的分离的聚核苷酸选自(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的聚核苷酸；(b)包含β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)核苷酸序列的聚核苷酸，所述的BBP来自保藏号为ATCC98617的克隆BBP-fl；(c)编码β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)的聚核苷酸，所述的BBP由保藏号为ATCC98617的克隆BBP-f1内的cDNA插入片段编码；(d)包含序列SEQ ID NO1中核苷酸202至核苷酸807的聚核苷酸；(e)包含β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)核苷酸序列的聚核苷酸，所述的BBP来自保藏号为ATCC98399的克隆pEK196；(f)编码β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)的聚核苷酸，所述的BBP由保藏号ATCC98399的克隆pEK196的cDNA插入片段编码；(g)编码含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的聚核苷酸；(h)编码如下蛋白质的聚核苷酸，该蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO2的片段，具有结合人β-淀粉样肽的活性，所述片段包含氨基酸序列SEQ ID NO2中氨基酸68至氨基酸269；(j)聚核苷酸，是以上聚核苷酸(a)-(f)的等位基因变异体；(k)编码上述蛋白质(g)-(h)的种族同系物的聚核苷酸；(l)在严谨条件下能够与(a)-(h)中任一聚核苷酸杂交的聚核苷酸。较好的是，所述的聚核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO1；保藏号为ATCC98617的克隆BBP-f1的β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)的核苷酸序列；或由保藏号为ATCC98617的克隆BBP-f1的cDNA插入片段编码的β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)的聚核苷酸。另一实施例提供的基因对应于序列SEQ ID NO1的cDNA。在另一实施例中，本专利技术提供了一种包含蛋白质的组合物，其中所述的蛋白质所含的氨基酸序列选自(a)氨基酸序列SEQ ID NO2(b)氨基酸序列SEQ ID NO2中的氨基酸68至氨基酸269；(c)由保藏号为ATCC98617的克隆BBP-f1的cDNA插入片段编码的氨基酸序列；(d)氨基酸序列SEQ ID NO2的片段，包含氨基酸序列SEQ ID NO2中氨基酸185至氨基酸217的氨基酸序列。较好的是，所述的蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO2，或其中的氨基酸68至氨基酸269。本专利技术还包括融合蛋白。在某些优选实施例中，所述的聚核苷酸与表达调控序列操作性连接。本专利技术还提供用这种聚核苷酸组合物转化的宿主细胞，包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。本专利技术还提供制备BBP的方法，它包括(a)在合适的培养基中培养权利要求3所述的宿主细胞培养物；和(b)从培养基中纯化蛋白质。本专利技术还提供包含与所述BBP特异性反应的抗体的组合物。本专利技术还提供了一些方法和诊断方法，用来检测以人BAP的表达为特征的疾病，和鉴定调节BBP活性的化合物的方法。本专利技术的另一实施例还包括转基因动物，它们含有与表达调控序列操作性连接的编码BBP的聚核苷酸。附图简述附图显示了本专利技术的某些实施例。它们只用来说明本专利技术，而不是对本专利技术的限定。附图说明图1酵母2-杂交筛选的设计。Y2H宿主菌株表达与BAP42(BAP BD；含TRP1标志的质粒)及非融合BAP42(BAP；含URA3标志的质粒)融合的Gal4 DNA-结合结构域，用表达所述Gal4活化结构域融合蛋白(未知AD)的人胎脑cDNA文库(含LEU2标志的质粒)转化该菌株。所以，菌株含有表达所示蛋白的(用圆环表示的)三种附加型质粒。蛋白质-蛋白质的正相互作用恢复了上游活化序列(GALUAS)的Gal4活性，由此诱导报道基因HIS3的转录。图2BBP/BAP结合的展示。分析Y2H菌株的组氨酸原养型制备10倍的连续稀释液，在没有色氨酸、亮氨酸、组氨酸但含有25mM 3-氨基噻唑的合成琼脂培养基上点加5μl。所有菌株都含有BAP融合蛋白的表达质粒pEK162，如标记BAP所示。第一列(载体)包含相互独立的衍生菌株，携有pEK162和表达一种非相关融合蛋白的载体pACT2，。以此作为衡量背景来与表达靶蛋白的菌株比较。以BBPDtm标示的各列表达来自pEK198的截短BBP，如本文所述。BAP与BBPDtm融合蛋白之间的相互作用恢复了Gal4活性，因此诱导报道基因HIS3的转录(参见图1)，可以观察到原养型生长比对照菌株加强了。图3证明BBP与Gα蛋白相互作用的生物试验。估计的BBP的胞外域表达成为Gal4 DNA结合结构域，具有表达为Gal4活化结构域融合蛋白的大鼠Gas，Gao或Gai2部分。由各自菌株分别衍生得到的两克隆的Y2H应答与没有G蛋白成份(载体)的细胞的应答相比较。图2的图例中说明了方法。图4BBP与BAP间相互作用的位置。BBPΔtm如本文所述分成重叠的两段。分析BBPΔC或BBPΔN这两种蛋白质与BAP的相互作用。图2的图例中说明了试验方法和以载体或BBPΔtm标示的菌株。以BBPΔC或BBPΔN标示的菌株表达融合蛋白形式的所示的BBP片段。图5人组织内(A)和脑部(B)内BBP mRNA的表达。分离自所述组织的经大小分离的2μg点印在聚ARNA的尼龙薄膜是，这些来本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的聚核苷酸，选自：（ａ）包含β－淀粉样肽结合蛋白ＢＢＰ的核苷酸序列的聚核苷酸，所述的ＢＢＰ来自保藏号为ＡＴＣＣ９８６１７的克隆ＢＢＰ１－ｆ１；（ｂ）编码β－淀粉样肽结合蛋白ＢＢＰ的聚核苷酸，所述的ＢＢＰ由保藏号为ＡＴＣＣ９８６１７的克隆ＢＢＰ１－ｆ１内ｃＤＮＡ插入片段编码；（ｃ）包含β－淀粉样肽结合蛋白ＢＢＰ的核苷酸序列的聚核苷酸，所述的ＢＢＰ来自保藏号为ＡＴＣＣ９８３９９的克隆ｐＥＫ１９６；（ｄ）编码β－淀粉样肽结合蛋白ＢＢＰ的聚核苷酸，所述的ＢＢＰ由保藏号为ＡＴＣＣ９８３９９的克隆ｐＥＫ１９６内ｃＤＮＡ插入片段编码；（ｅ）聚核苷酸，是以上聚核苷酸（ａ）－（ｄ）的等位基因变异体；（ｆ）在严谨条件下能够与（ａ）－（ｄ）中任一聚核苷酸杂交的聚核苷酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：BA奥藏伯格，EM卡科斯基，JS雅各布森，JA巴德，SG沃克，H索菲娅，
申请(专利权)人：惠氏，
类型：发明
国别省市：US[美国]