从D-氨基酸制备L-氨基酸的方法技术

本发明专利技术涉及重组微生物，其与起始微生物相比具有更高浓度或活性的Ｄ－氨基酸氧化酶、Ｌ－氨基酸脱氢酶、ＮＡＤＨ共底物再生酶的一种，及如果需要还有过氧化氢酶，本发明专利技术还涉及一种通过使用这些微生物从Ｄ－氨基酸制备Ｌ－氨基酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及重组微生物，其与起始微生物相比具有更高浓度或活性的D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶、NADH共底物再生酶中的一种、并且如果需要还具有过氧化氢酶，本专利技术还涉及通过使用这些微生物从D-氨基酸制备L-氨基酸的方法。目前许多天然氨基酸是通过用遗传优化的细菌进行发酵而以对映异构体纯的形式而制备(de Graaf AA，Eggeling L，Sahm H 2001.Metabolic Engineering for L-Lysine Production by Corynebacteriumglutamicum.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.739-29；Sahm H，Eggeling L，Eikmanns B，Kramer R.1996，Construction of L-Lysine-，L-Threonine-，and L-Isoleucin Overproducing Strains of CorynebacteriumGlutamicum.Ann N Y Acad Sci 78225-39)。诚然，不是所有的蛋白质氨基酸(proteinogenic amino acids)并且仅极少数非天然氨基酸和D-氨基酸可以这种方式制备。由于对映异构体纯的氨基酸的化学合成非常昂贵，因此已经开发了一系列酶学方法，其中一些方法已经可以达到每年生产数吨的规模。所述方法的范围包括从借助于酰基转移酶、酰胺酶、酯酶、海因酶(hydantoinase)、氨基酸氧化酶和蛋白酶的动态外消旋物裂解到利用裂合酶、氨基转移酶和脱氢酶的对映体选择性合成(Schmid A.et al.(2002)“The Use of Enzymes in the Chemical Industry in Europe”，Curr Opin Biotechnol 13(4)359-366)。除了对映体选择性合成法之外，动态外消旋物裂解(dynamischkinetische Racematspaltungen)也特别有效，其中不希望的对映异构体被原位外消旋化。在动态外消旋物裂解中，通过组合D-或L-氨基酸氧化酶与非选择性化学还原初始亚氨基酸为主要氨基酸，也可以达到100％得率。然而，还原剂如NaBH4必须以至少25倍当量过量应用，这样导致这种方法非常昂贵(Enright et al.，“Stereoinversion ofBeta-and Gamma-Substituted Alpha Amino Acids Using a Chemo-Enzymatic Oxidation-Reduction Procedure”，Chemical Communications(2003)，(20)，2636-2637.)本领域通常已知氨基酸脱氢酶对α-酮酸的氨基化。然而无可否认所得离析物与例如相应的外消旋氨基酸相比更加昂贵许多倍。然而，通过联合氨基酸氧化酶与氨基酸脱氢酶，可以从氨基酸原位获得相应的酮酸。当这两种酶具有相反的对映体选择性时，D-氨基酸可以完全转变为L-氨基酸或者L一氨基酸完全转变为D-氨基酸。从外消旋物开始，从中可以产生对映异构体纯的化合物。在此NADH共底物必须使用酶再生，因为其太昂贵以至于不能以化学计量的量应用。从其底物中释放二氧化碳并因此使得反应不可逆的酶如甲酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶(脱羧化)是特别适用的(Hanson，R.L.et al.“Enzymatic Synthesis of L-6-Hydroxynorisoleucine”，Bioorganic & Medicinal Chemistry(1999)，7(10)，2247-2252，及Nakajima N.et al.，“Enzymatic Conversion of Racemic Methionine to theL-Enantiomer”，Journal of the Chemical Society，ChemicalCommunications(1990)，(13)，947-8)。 然而为了在无细胞系统中迅速并完全地转化，必须存在过氧化氢酶，因为在由氨基酸氧化酶催化的氧化步骤中，产生过氧化氢，导致酮酸脱羧化及所述酶失活(Trost，E.-M.；Fischer，L.，“Minimization of By-Product Formation during D-Amino Acid OxidaseCatalyzed Racemate Resolution of D/L-Amino Acids”，Journal ofMolecular Catalysis BEnzymatic(2002)，19-20 189-195)。外消旋的氨基酸转化为对映异构体纯的氨基酸在这个系统中可以达到＞99％ee和＞95％的得率。然而这种方法昂贵，因为必须单独制备和分离4种不同的酶。本专利技术的目的是提供一种方法，该方法可以避免昂贵地分离和提供将D-氨基酸转化为L-氨基酸所需的酶。本专利技术的主题优选是重组微生物的静态细胞，其与起始微生物例如野生型微生物相比具有更高浓度或活性的D-氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶、NADH共底物再生酶及如果需要还有过氧化氢酶。根据要被转化的底物和所述酶的底物范围组合氧化酶和脱氢酶。由此起始生物体当然不必须含有所述酶。甲酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶(德国专利102 40 603)或者醇脱氢酶可以用作NADH共底物的再生酶。这种酶的编码多核苷酸的来源通常不限于重组微生物的菌株或者菌种。转化宿主生物体的基因可以不用考虑来源而选择。基因的来源可以是微生物、霉菌或者酵母，尤其对于D-AAO是原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protophormiae)或者变异三角酵母(trigonopsis variabilis)，对于LeuDH是腊状芽孢杆菌(bacilluscereus)。存在稳定表达系统的微生物优选用作宿主生物体，例如芽孢杆菌属、多种霉菌、葡萄球菌属或者链霉菌属，特别是大肠杆菌(E.coli)。特别合适的氨基酸脱氢酶是来自芽孢杆菌属的L-亮氨酸脱氢酶(EP 792 933)，来自红球菌(rhodococcus)属的谷氨酸脱氢酶、L-苯丙氨酸脱氢酶，来自高温放线菌属(thermoactinomyces)或者芽孢杆菌菌株的L-丙氨酸脱氢酶。根据要被还原氨化的酮酸选择所述酶。本专利技术的D-氨基酸氧化酶或者其编码多核苷酸均源自纤细红酵母(rhototorula gracillis)(美国专利6,187,574)、变异三角酵母(Long-Liu Lin et al.，Enzyme and Microbial Technol.27(2000)，482-491)、念珠菌属(Candida)菌种、粗糙链孢霉(neurospora crassa)、verlicullium luteoralbo及不同的镰刀霉菌种，D-氨基酸氧化酶源自原玻璃蝇节杆菌(欧洲专利1 375 649)。关于不同D-AAO的底物的综述可见于Gabler等(EnzymeMicrobiol.Technol.27(8)605-611(2000))所述。在欧洲专利897 0本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组微生物，其与起始微生物相比具有更高浓度或活性的Ｄ－氨基酸氧化酶、Ｌ－氨基酸脱氢酶、ＮＡＤＨ共底物ＮＡＤＨ再生酶之一，如果需要则还具有过氧化氢酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：维尔纳胡梅尔，比吉特戈伊克，斯特芬奥斯瓦尔德，克里斯托夫韦克贝克，克劳斯胡特马赫尔，
申请(专利权)人：德古萨股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]