本发明专利技术公开了一种蜂蜜中氨基酸的测定方法，其特征在于：前处理选用含有内标的稀盐酸超声萃取蜂蜜样品，过滤膜后直接进入高效液相串联质谱仪进行测定，内标法定量。本方法采用直接进样，可快速、准确检测出蜂蜜中21种氨基酸的含量。本发明专利技术克服了现有技术样品处理方法的不足，与传统的柱前衍生方式比较，直接进样，无交叉污染，样品待测物质损失少，实验过程不使用有毒有害化学品，对操作人员危害小，易于操作。针对蜂蜜基质复杂的特征采用优化的梯度洗脱程序，消除干扰，回收率高，测定结果准确。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，其特征在于：前处理选用含有内标的稀盐酸超声萃取蜂蜜样品，过滤膜后直接进入高效液相串联质谱仪进行测定，内标法定量。本方法采用直接进样，可快速、准确检测出蜂蜜中21种氨基酸的含量。本专利技术克服了现有技术样品处理方法的不足，与传统的柱前衍生方式比较，直接进样，无交叉污染，样品待测物质损失少，实验过程不使用有毒有害化学品，对操作人员危害小，易于操作。针对蜂蜜基质复杂的特征采用优化的梯度洗脱程序，消除干扰，回收率高，测定结果准确。【专利说明】
本专利技术属于理化检验
，具体涉及蜂蜜中氨基酸含量的测定方法。
技术介绍
氨基酸是蛋白质的基本组成单位，也是生物体的主要组成物质。氨基酸分析在工业、医药、农业生产、食品加工及生命科学研究中十分重要。蜂蜜中氨基酸是蜂蜜的主要营养成分，不同产地不同花型的蜂蜜的氨基酸种类和含量差异很大，分析蜂蜜中氨基酸种类和含量对研究蜂蜜的营养价值具有重要的意义。有关蜂蜜中氨基酸的检测标准和方法较少，与国际标准差距很大，因此加强检测方法和标准的研究势在必行。目前蜂蜜中氨基酸的测定多采用柱前衍生高效液相色谱法和氨基酸分析仪测定法。这些方法大多需要利用衍生化反应才能进行检测，存在衍生试剂有毒、易见光分解、衍生洗脱后定量困难的问题，而本专利技术采用稀盐酸超声提取，过滤膜后直接进入高效液相串联质谱仪进行检测，可减少了氨基酸柱前衍生反应的前处理时间，消除交叉污染，减少样品损失。
技术实现思路
本专利技术克服现有技术的不足，提供一种新的蜂蜜中氨基酸含量的测定方法。本专利技术的技术方案是提供一种蜂蜜中氨基酸含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤:萃取液的制备:用0.03mol/L的HCl溶解定量的L-正缬氨酸，制备成含2 μ mol/LL-正缬氨酸的0.03mol/L的HCl溶液，作为萃取液。标准工作溶液制备:用`上述萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标I (脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、异亮氨酸(lie)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、甲硫氨基酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、纟颜氨酸(Val)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、甘氨酸(Gly)250pmOL/l.! L和4种氨基酸混合标准储备液II (天冬酰胺(Asn)、色氨酸(Trp)、谷氨酰胺(Gin)、羟脯氨酸(HpiO)，浓度为100 μ mol/L)配成不同系列浓度的标准溶液。进行高效液相一串联质谱检测；然后以被测物的峰面积与其内标的峰面积的比值(Y)对被测物的浓度(X)进行线性回归，求得各氨基酸的标准曲线；(2)样品制备和分析:准确称取0.5g待测蜂蜜样品，放入50mL磨口三角瓶中，准确加入25mL萃取液，超声15min，取出后摇荡锥形瓶片刻使其混合均匀，经0.22 μ m滤膜过滤后进行高效液相一串联质谱分析；(3)色谱分离条件:色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse AAA 色谱柱，AgilentZORBAX Eclipse AAA预柱；流速:0.6mL/min ;柱温:40°C;进样量:5 μ L ;流动相A:乙腈，流动相B:0.1 %甲酸，梯度洗脱条件如下【权利要求】1.，其特征在于:用含有内标的稀盐酸萃取液超声萃取蜂蜜样品，过滤膜后直接进入高效液相一串联质谱仪进行测定，内标法定量。2.根据权利要求1所述的，其特征在于，所述内标物为L-正缬氨酸。3.根据权利要求1所述的，其特征在于，所述含有内标的稀盐酸萃取液为含L-正缬氨酸的浓度为2 μ mol/L的0.03mol/L的HCl溶液。4.根据权利要求1所述的，其特征在于，所述滤膜为0.22 μ m 滤膜。5.根据权利要求1-4任一所述的,其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)萃取液的制备:用0.03mol/L的HCl溶解定量的L-正缬氨酸，配制成含L-正缬氨酸2 μ mol/L的0.03mol/L的HCl溶液，作为萃取液； (2)标准工作溶液制备:用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标I和4种氨基酸混合标准储备液II配成不同系列浓度的标准溶液，进行高效液相一串联质谱检测；然后以被测物的峰面积与其内标的峰面积的比值Y对被测物的浓度X进行线性回归，求得各氨基酸的标准曲线； (3)样品制备和分析:准确称取0.5g待测蜂蜜样品，放入50mL磨口三角瓶中，准确加入25mL萃取液,超声15min,取出后摇荡锥形瓶片刻使其混合均匀，经0.22 μ m滤膜过滤后进行高效液相一串联质谱分 析。6.根据权利要求5所述的，其特征在于:所述步骤中的色谱条件如下: 色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse AAA 色谱柱，Agilent ZORBAX Eclipse AAA 预柱； 流速:0.6mL/min ； 柱温:40°C ； 进样量:5yL; 流动相A:乙腈，流动相B:0.1 %甲酸； 梯度洗脱。7.根据权利要求5所述的，其特征在于:所述步骤中的质谱条件如下: 离子源:电喷雾电离源(ESI)； 扫描方式:正离子扫描； 检测方式:多反应监测(MRM)； 电喷雾电压:5000V ； 离子源温度:350°C ； 辅助气Gasl压力:60psi ； 辅助气Gas2压力:50psi ； 去簇电压(DP):18V。8.根据权利要求7所述的，其特征在于:该方法包括以下步骤:(1)萃取液的制备:用0.03mol/L的HCl溶解定量的L-正缬氨酸，配制成含L-正缬氨酸2 μ mol/L的0.03mol/L的HCl溶液,作为萃取液； (2)标准工作溶液制备:用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标I和4种氨基酸混合标准储备液II配成不同系列浓度的标准溶液，进行高效液相一串联质谱检测；然后以被测物的峰面积与其内标的峰面积的比值Y对被测物的浓度X进行线性回归，求得各氨基酸的标准曲线； (3)样品制备和分析:准确称取0.5g待测蜂蜜样品，放入50mL磨口三角瓶中，准确加入25mL萃取液,超声15min,取出后摇荡锥形瓶片刻使其混合均匀，经0.22 μ m滤膜过滤后进行高效液相一串联质谱分析； 色谱条件如下:色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse AAA 色谱柱，Agilent ZORBAXEclipse AAA预柱；流速:0.6mL/min ;柱温:40°C ;进样量:5yL ;流动相A:乙腈，流动相B:·0.1 %甲酸；梯度洗脱； 质谱条件为:离子源:电喷雾电离源(ESI);扫描方式:正离子扫描；检测方式:多反应监测(MRM);电喷雾电压:5000V;离子源温度:350°C;辅助气Gasl压力:60psi ;辅助气Gas2压力:50psi ;去簇电压(DP):18V。【文档编号】G01N30/06GK103713078SQ201310744335【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日 【专利技术者】陈志燕, 范忠, 孟冬玲, 田兆福, 李小兰, 徐雪芹 申请人:广西中烟工业有限责任公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蜂蜜中氨基酸的测定方法，其特征在于：用含有内标的稀盐酸萃取液超声萃取蜂蜜样品，过滤膜后直接进入高效液相－串联质谱仪进行测定，内标法定量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈志燕，范忠，孟冬玲，田兆福，李小兰，徐雪芹，
申请(专利权)人：广西中烟工业有限责任公司，
类型：发明
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