小鹅瘟抗体检验标准物质及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种小鹅瘟抗体检验标准物质及其制备方法。本发明专利技术所述小鹅瘟抗体检验标准物质包括:小鹅瘟琼扩抗原、小鹅瘟阳性血清和小鹅瘟阴性血清。其中，所述小鹅瘟琼扩抗原的制备包括:将鹅细小病毒毒株接种易感鹅胚，收获鹅胚液，得到抗原液；向抗原液中加入冻干保护剂，冷冻干燥即得。所述小鹅瘟阳性血清的制备包括:将鹅细小病毒毒株接种易感鹅胚，收获鹅胚液，得到抗原液；将抗原液经浓缩灭活后制备小鹅瘟免疫原，免疫健康易感鹅，采血，分离血清，冷冻干燥即得。所述小鹅瘟阴性血清的制备包括:对小鹅瘟抗体呈阴性成鹅采血，分离血清，冷冻干燥即得。本发明专利技术小鹅瘟抗体检验标准物质的特异性好，定值准确性高，在小鹅瘟防控中具有应用前景。

Gosling plague antibody test standard substance and preparation method thereof

【技术实现步骤摘要】
小鹅瘟抗体检验标准物质及其制备方法
本专利技术涉及小鹅瘟抗体检验标准物质，还涉及所述小鹅瘟抗体检验标准物质的制备方法，属于小鹅瘟抗体检验标准物质的制备领域。
技术介绍
小鹅瘟是由鹅细小病毒(GooseParvovirus，GPV)引起的雏鹅急性或亚急性败血性传染病。该病是中国学者方定一于1956年首次在江苏扬州发现，60年代以来，在欧洲、亚洲等国家相继报道该病的发生与流行。1974年，国际禽病学会(WPSA)正式将该病命名为Derzsys氏病。该病主要侵害出壳后4～20日龄的雏鹅，也感染雏鸭，传播速度快，发病率和死亡率高达90％～100％，特别是近年来在中国一些省、市、自治区均有流行，给养鹅业造成严重危害，带来重大的经济损失，受到中国国内外畜牧兽医工作者的广泛关注。然而，小鹅瘟抗体检测标准物质的质量要求高，制备方法和检验、标定方法严格，有关制备程序和标定方法至今未见报道，因此病毒检测、产品检验、科学研究等难度加大，实验结果易受人员的经验、能力以及实验设施、环境的影响而存在较大误差，严重制约了小鹅瘟的防控。因此，亟需使用标准物质作为客观、公正的标尺，用于产品质量控制、科学研究与实验室诊断的参照以及实验室之间的能力比对。中药多糖，特别是补益类中药多糖具有增强机体免疫功能的作用，且安全、无毒，是良好的生物反应调节剂，有望开发成为新型疫苗佐剂。试验证实黄芪多糖能显著提高机体免疫功能，对多种疫苗具有免疫增效作用。目前，应用黄芪多糖配合小鹅瘟疫苗共同免疫的相关内容，还未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种小鹅瘟抗体检验标准物质及其制备方法，本专利技术所制备的小鹅瘟抗体检验标准物质特异性好，适用范围广，定值准确性高。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了一种小鹅瘟抗体检验标准物质，包括:小鹅瘟琼扩抗原、小鹅瘟阳性血清和小鹅瘟阴性血清。本专利技术进一步公开了所述小鹅瘟抗体检验标准物质的制备方法。其中，所述小鹅瘟琼扩抗原的制备包括:(1)将鹅细小病毒(GooseParvovirus，GPV)毒株接种易感鹅胚，收获鹅胚液，得到抗原液；(2)向抗原液中加入冻干保护剂，混匀，冷冻干燥，即得。步骤(1)所述鹅细小病毒毒株优选为鹅细小病毒H株，其微生物保藏编号为:CGMCCNo.6851。本专利技术所述鹅细小病毒H株由哈药集团生物疫苗公司分离，并经电镜负染形态观察、鹅胚感染中和试验、病毒基因组PCR检测及核苷酸序列测定等，确定为鹅细小病毒，命名为鹅细小病毒H株(GPV-H)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国专利技术专利ZL201210543550.9)。步骤(1)所述抗原液的病毒含量为:每0.2ml抗原液的病毒含量≥105.0ELD50(鹅胚半数致死量)；步骤(1)所述易感鹅胚优选为12日龄易感鹅胚；所述鹅胚液为孵育72-168小时内死亡的鹅胚的鹅胚液；所述孵育的温度为37℃。步骤(2)按照体积比计，抗原液:冻干保护剂＝1-3:1-3，优选为1:1。所述冻干保护剂由蔗糖、脱脂乳和水组成；优选的，按g/ml计，所述冻干保护剂中蔗糖的终浓度为2.5％，脱脂乳的终浓度为2.5％，余量为水。本专利技术所述的小鹅瘟抗体检验标准物质中，所述小鹅瘟阳性血清的抗体效价≥1:32(经琼脂扩散实验测定)。本专利技术所述小鹅瘟阳性血清的制备包括:(1)将鹅细小病毒毒株接种易感鹅胚，收获鹅胚液，得到抗原液；(2)将抗原液浓缩、灭活，得到的灭活抗原制备小鹅瘟免疫原；(3)将小鹅瘟免疫原免疫健康易感鹅，采血，分离血清，冷冻干燥，即得。所述小鹅瘟阳性血清的制备方法中，步骤(1)所述鹅细小病毒毒株优选为鹅细小病毒H株，其微生物保藏编号为:CGMCCNo.6851；所述鹅胚液为孵育72-168小时内死亡的鹅胚的鹅胚液(所述孵育的温度为37℃)；所述抗原液的病毒含量为:每0.2ml抗原液的病毒含量≥105.0ELD50；所述易感鹅胚优选为12日龄易感鹅胚。本专利技术所述鹅胚液包括尿囊液和羊水。步骤(2)所述浓缩为将抗原液进行10倍浓缩；优选的，所述浓缩包括：将抗原液离心，取上清液，用截留分子量为50kDa的超滤膜包进行10倍浓缩；所述灭活包括:按体积比计，向浓缩后的抗原中加入终浓度为0.2％甲醛溶液(体积百分比)，混匀，37℃灭活48小时(期间6-8小时振摇1次)。步骤(2)所述小鹅瘟免疫原的制备包括:(a)将灭活抗原与吐温-80混合均匀，得到水相；(b)将注射用白油、硬脂酸铝与司本-80混合均匀，灭菌，得到油相；(c)将水相与油相混合，乳化，即得。其中，步骤(a)按体积比计，灭活抗原:吐温-80＝96:4；步骤(b)按体积比计，注射用白油:硬脂酸铝:司本-80＝94:1.5:6；步骤(b)优选为，先将注射用白油与硬脂酸铝混合，直至完全透明，再加入司本-80；步骤(c)按体积比计，水相:油相＝1:1.5。步骤(3)所述免疫的程序包括:基础免疫，基础免疫后14日进行加强免疫，加强免疫后14日进行强化免疫。其中，所述基础免疫的接种剂量为:小鹅瘟免疫原1.0-2.0ml及黄芪多糖注射液1.0ml；所述加强免疫的接种剂量为:小鹅瘟免疫原1.0-3.0ml及黄芪多糖注射液1.0ml；所述强化免疫的接种剂量为:小鹅瘟免疫原1.0-3.0ml及黄芪多糖注射液1.0ml；优选的，所述基础免疫的接种剂量为:小鹅瘟免疫原1.0ml及黄芪多糖注射液1.0ml；所述加强免疫的接种剂量为:小鹅瘟免疫原2.0ml及黄芪多糖注射液1.0ml；所述强化免疫的接种剂量为:小鹅瘟免疫原3.0ml及黄芪多糖注射液1.0ml。所述免疫的接种途径为肌肉注射，优选为胸部肌肉多点注射。步骤(3)所述采血为强化免疫后14日进行采血。本专利技术所述黄芪多糖注射液中黄芪多糖的含量为20mg/ml；所述黄芪多糖采用水提醇沉法提取。本专利技术对小鹅瘟免疫程序中小鹅瘟免疫原的接种剂量优化结果表明，基础免疫、加强免疫及强化免疫的接种量分别为1.0、2.0和3.0ml，或者2.0、2.0和3.0ml，或者2.0、3.0和3.0ml，上述三种免疫程序强化免疫14日抗体琼扩抗体效价几何平均值明显高于其它接种剂量。本专利技术考虑到免疫原的用量以及对动物机体的伤害，确定免疫原最佳接种剂量为：基础免疫的接种剂量为小鹅瘟免疫原1.0ml；基础免疫后14日进行加强免疫，接种剂量为小鹅瘟免疫原2.0ml；加强免疫后14日进行强化免疫，接种剂量为小鹅瘟免疫原3.0ml。本专利技术进一步在免疫原最佳接种剂量基础上，在基础免疫、加强免疫及强化免疫中接种小鹅瘟免疫原的同时分别增加黄芪多糖注射液1.0ml。从抗体产生效价来看，加黄芪多糖组在强化免疫后14日抗体效价几何平均值达到1:119.43，比未加黄芪多糖组抗体效价几何平均值提高近2倍。说明，黄芪多糖能提高小鹅瘟免疫原免疫后鹅只的抗体效价。因此，本专利技术确定免疫程序中，基础免疫的接种剂量为:小鹅瘟免疫原1.0ml及黄芪多糖注射液1.0ml；加强免疫的接种剂量为:小鹅瘟免疫原2.0ml及黄芪多糖注射液1.0ml；强化免疫的接种剂量为:小鹅瘟免疫原3.0ml及黄芪多糖注射液1.0ml。本专利技术所述的小鹅瘟抗体检验标准物质中，所述小鹅瘟阴性血清的制备包括:对小鹅瘟抗体呈阴性的成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鹅瘟抗体检验标准物质，其特征在于，包括:小鹅瘟琼扩抗原、小鹅瘟阳性血清和小鹅瘟阴性血清。

【技术特征摘要】
1.一种小鹅瘟抗体检验标准物质，其特征在于，包括:小鹅瘟琼扩抗原、小鹅瘟阳性血清和小鹅瘟阴性血清。2.按照权利要求1所述的小鹅瘟抗体检验标准物质，其特征在于，所述小鹅瘟琼扩抗原的制备包括:(1)将鹅细小病毒毒株接种易感鹅胚，收获鹅胚液，得到抗原液；(2)向抗原液中加入冻干保护剂，混匀，冷冻干燥，即得。3.按照权利要求2所述的小鹅瘟抗体检验标准物质，其特征在于，步骤(1)所述抗原液的病毒含量为:每0.2ml抗原液的病毒含量≥105.0ELD50；步骤(1)所述鹅细小病毒毒株优选为鹅细小病毒H株，其微生物保藏编号为:CGMCCNo.6851；步骤(1)所述鹅胚液为孵育72-168小时内死亡的鹅胚的鹅胚液。4.按照权利要求2所述的小鹅瘟抗体检验标准物质，其特征在于，步骤(2)按照体积比计，抗原液:冻干保护剂＝1-3:1-3，优选为1:1；优选的，所述冻干保护剂由蔗糖、脱脂乳和水组成；更优选的，按g/ml计，所述冻干保护剂中蔗糖的终浓度为2.5％，脱脂乳的终浓度为2.5％，余量为水。5.按照权利要求1所述的小鹅瘟抗体检验标准物质，其特征在于，所述小鹅瘟阳性血清的制备包括:(1)将鹅细小病毒毒株接种易感鹅胚，收获鹅胚液，得到抗原液；(2)将抗原液浓缩、灭活，得到的灭活抗原制备小鹅瘟免疫原；(3)将小鹅瘟免疫原免疫健康易感鹅，采血，分离血清，冷冻干燥，即得；所述小鹅瘟阳性血清的抗体效价≥1:32。6.按照权利要求5所述的小鹅瘟抗体检验标准物质，其特征在于，步骤(1)所述鹅细小病毒毒株优选为鹅细小病毒H株，其微生物保藏编号为:CGMCCNo.6851；所述鹅胚液为孵育72-168小时内死亡的鹅胚的鹅胚液；所述抗原液的病毒含量为:每0.2ml抗原液的病毒含量≥105.0ELD50；步骤(2)所述浓缩为将抗原液进行10倍浓缩；优选的，所述浓缩包括:将抗原液离心，取上清液，用截留分子量为50kDa的超滤膜包进行10倍浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：藏玉婷，柴华，梁宛楠，赵辉，张春媛，李鑫，邢育钢，宋扬，刘鑫莹，郭照成，陈欣，孙晓峰，李建华，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23