基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因R356P突变的检测试剂制造技术

本发明专利技术公开了一种基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因R356P突变的检测试剂、PCR检测方法及应用，检测试剂包括引物、肽核酸荧光探针及野生型互补的肽核酸序列，正向引物如序列表中SEQ ID NO.1、NO.3、NO.5、NO.7；反向引物如序列表中SEQ ID NO.2、NO.4、NO.6、NO.8；肽核酸荧光探针如序列表中SEQ ID NO.9、NO.10、NO.11、NO.12；野生型互补肽核酸序列如序列表中SEQ ID NO.13、NO.14、NO.15、NO.16。本发明专利技术从转录水平能快速发现Wnt信号通路中Pygo2基因的变情况，为抗癌药物筛选，新靶向药物探讨、基础科学研究提供工具。

Detection reagent for R356P mutation of Pygo2 gene in Wnt signal pathway based on peptide nucleic acid probe

The invention discloses a Pygo2 signal pathway of Wnt peptide nucleic acid probes in R356P gene mutation detection reagent, PCR detection method and application based on the detection reagent including peptide nucleic acid sequence primer, peptide nucleic acid fluorescence probe and complementary wild type, such as forward primer sequence list SEQ ID NO.1, NO.3, NO.5, NO.7 the reverse primer in the sequence list; such as SEQ ID NO.2, NO.4, NO.6, NO.8; peptide nucleic acid fluorescent probes such as SEQ ID in a sequence list NO.9, NO.10, NO.11, NO.12; wild type complementary peptide nucleic acid sequences such as SEQ sequence list ID NO.13, NO.14, NO.15, NO.16. The invention can rapidly detect the change of Pygo2 gene in Wnt signaling pathway from transcriptional level, and provide tools for screening anticancer drugs, exploring new target drugs and basic scientific research.

【技术实现步骤摘要】
基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因R356P突变的检测试剂本专利技术是《基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂、PCR检测方法及应用》(专利申请号2015103553148，申请日20150624)的分案申请。
本专利技术属于分子生物学生物核酸检测
，具体涉及一种基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂、PCR检测方法及应用。
技术介绍
Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。Wnt信号通路包括经典的Wnt信号通路与非经典的Wnt信号通路，在经典通路即Wnt-β-catenin信号通路中，Wnt因子通过激活细胞膜上的Frizzle/LRP5/6协同受体后抑制细胞内游离β-catenin蛋白的磷酸化和降解，细胞质中的β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能够联合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同与TCF/LEF-1转录因子家族形成复合体并激活Wnt信号通路下游靶基因的转录激活。Pygo2蛋白是Wnt信号通路中β-catenin下游重要成员之一，目前越来越多的研究已经发现，在很多肿瘤中Pygo2蛋白均呈现高表达。目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段，虽然近年来Wnt信号通路在癌症中的研究，以及Pygo2蛋白作为Wnt信号通路重要成员其表达水平的研究，已经成为研究开发肿瘤药物急需解决的重要问题，但是同时其在很多肿瘤细胞中基因的突变也越来越多，尤其是在Pygo2蛋白NHD端及PHD端发生的突变，对Pygo2蛋白发挥功能启动非常重要的作用，例如在膀胱癌细胞中检测出NHD端R46S突变，胰腺癌细胞中检测出P98H突变，肺腺癌细胞中检测出的PHD端R334Q突变以及急性骨髓性白血病中检测出的R356P突变。肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现状，旨在提供一种能确定Wnt信号通路中核心的信号分子Pygo2基因突变情况，能解释核心分子Pygo2在肿瘤细胞中变化，结果重复性，敏感性好的基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因R356P突变的检测试剂。本专利技术目的的实现方式为，基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因R356P突变的检测试剂,包括引物和探针，所述引物包括正向引物和反向引物，所述探针为肽核酸探针，其特征在于：所述检测Pygo2基因R356P突变正向引物如序列表中SEQIDNO.7；所述检测Pygo2基因R356P突变反向引物如序列表中SEQIDNO.8；所述检测Pygo2基因R356P突变PNA荧光探针如序列表中SEQIDNO.12；所述肽核酸荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，修饰所述3'端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂进行检测的方法，检测方法为基于肽核酸为荧光探针的实时荧光定量PCR方法；所述实时荧光定量PCR的反应体系为：正向引物、反向引物、DEPC水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCRBuffer、RNASIN、M-MLV逆转录酶、oligo(dT)和含Mg离子的溶液；所述具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂的应用，用于制备检测肿瘤细胞及正常细胞的检测试剂，所述癌细胞为膀胱癌细胞、胰腺癌细胞、肺腺癌细胞或急性骨髓性白血病血细胞。本专利技术采用特异序列的PNA寡聚物作为探针。由于PNA是一种人工合成的核酸的类似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶基因结合时因电荷相互排斥所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优势，大大提高了检测灵敏度。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果是:Pygo2基因是新发现的Wnt信号通路中β-catenin蛋白下游的发挥着重要功能的基因，借助本专利技术提供的检测试剂能够通过实时荧光定量PCR法在转录水平快速检测出Pygo2基因的突变，而与普通实时荧光定量PCR不同的是，本申请人使用的肽核酸PNA荧光探针更加灵敏，本专利技术为抗癌药物的筛选，新靶向药物的机制研究都提供了非常有力的工具。附图说明图1是本专利技术实施例中所述肽核酸质谱图；图2是本专利技术实施例中所述R46S突变型和野生型参考品PCR扩增图；图3是本专利技术实施例中所述P98H突变型和野生型参考品PCR扩增图；图4是本专利技术实施例中所述R334Q突变型和野生型参考品PCR扩增图；图5是本专利技术实施例中所述R356P突变型和野生型参考品PCR扩增图。具体实施方式基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂，所述引物包括正向引物和反向引物，所述探针为肽核酸探针，其特征在于：所述检测Pygo2基因R356P突变正向引物如序列表中SEQIDNO.7；所述检测Pygo2基因R356P突变反向引物如序列表中SEQIDNO.8；所述检测Pygo2基因R356P突变PNA荧光探针如序列表中SEQIDNO.12。所述肽核酸荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，修饰所述3'端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。检测试剂还含有对比试剂，对比试剂为与Pygo2基因野生型互补的肽核酸序列，所述特异性结合包含Pygo2基因356密码子野生型PNA序列如序列表中SEQIDNO.16。本专利技术所用肽核酸的质谱图见图1。用基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂进行检测的方法，检测方法为PCR检测方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因R356P突变的检测试剂，包括引物和探针，所述引物包括正向引物和反向引物，所述探针为肽核酸探针，其特征在于：所述检测Pygo2基因R356P突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.7；所述检测Pygo2基因R356P突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.8；所述检测Pygo2基因R356P突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.12；所述肽核酸荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，修饰所述3'端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

【技术特征摘要】
1.基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因R356P突变的检测试剂，包括引物和探针，所述引物包括正向引物和反向引物，所述探针为肽核酸探针，其特征在于：所述检测Pygo2基因R356P突变正向引物如序列表中SEQIDNO.7；所述检测Pygo2基因R356P突变反向引物如序列表中SEQIDNO.8；所述检测Pygo2基因R356P突变PNA荧光探针如序列表中SEQIDNO.12；所述肽核酸荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐景峰，周策凡，陈兴珍，张毅，代俊，周梦舟，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42