用于轴抑制蛋白（AXIN2）基因P435Q突变检测的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了用于轴抑制蛋白（AXIN2）基因P435Q突变检测的试剂盒，属于生物技术及临床分子诊断技术领域。本发明专利技术试剂盒包括用于特异性检测AXIN2基因P435Q突变的引物对（SEQ ID NO.1、2）和肽核酸荧光探针（SEQ ID NO.3），用于阻断野生型AXIN2基因扩增的肽核酸探针（SEQ ID NO.4），还包括检测内参的引物对和肽核酸荧光探针（SEQ ID NO.5‑7）、阳性参考品、阴性参考品以及PCR试剂等。本发明专利技术从转录水平能快速发现Wnt信号通路中AXIN2基因突变情况，为抗癌药物筛选、新靶向药物探讨、基础科学研究提供工具。

【技术实现步骤摘要】
用于轴抑制蛋白(AXIN2)基因P435Q突变检测的试剂盒
本专利技术涉及生物技术及临床分子诊断
，具体涉及一种用于轴抑制蛋白(AXIN2)基因P435Q突变检测的试剂盒。
技术介绍
Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。Wnt信号通路包括经典的Wnt信号通路与非经典的Wnt信号通路，在经典通路即Wnt-β-catenin信号通路中，Wnt因子通过激活细胞膜上的Frizzle/LRP5/6协同受体后抑制细胞内游离β-catenin蛋白的磷酸化和降解，细胞质中的β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能够联合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同与TCF/LEF-1转录因子家族形成复合体并激活Wnt信号通路下游靶基因的转录激活。AXIN2蛋白是Wnt信号通路中β-catenin上游重要成员之一。其主要作用是能够与APC(adenomatouspolyposiscoli)、GSK3β、CK1等蛋白结合形成复合体，促进细胞质中β-catenin的降解。目前越来越多的研究已经发现，在很多肿瘤中AXIN2蛋白均呈现不同程度的突变。目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段，虽然近年来Wnt信号通路在癌症中的研究，以及AXIN2蛋白作为Wnt信号通路重要成员其突变水平的研究，已经成为研究开发肿瘤药物急需解决的重要问题，尤其是在AXIN2-β-catenin结合结构域中发生的突变，对AXIN2蛋白发挥功能启动非常重要的作用，例如在肾透明细胞癌细胞中检测出P435Q突变等。肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。本专利技术采用特异序列的PNA寡聚物作为探针。由于PNA是一种人工合成的核酸的类似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶基因结合时因电荷相互排斥所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优势，大大提高了检测灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中如何确定Wnt信号通路中核心的信号分子AXIN2基因突变情况，以及如何解释核心分子AXIN2在肿瘤细胞中的突变水平变化的困难，提供了一种检测Wnt信号通路中AXIN2基因突变的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒中包括检测AXIN2基因突变的肽核酸PNA荧光探针(用于特异性检测AXIN2基因P435Q突变的肽核酸荧光探针)，通过联合肽核酸PNA荧光探针的PCR方法，能够更加灵敏的检测细胞中AXIN2基因发生的突变，并且为研究Wnt信号通路提供最直接的证据；该试剂盒中还包括：检测AXIN2基因突变所需的与AXIN2基因野生型互补杂交的一段肽核酸PNA探针(用于阻断野生型AXIN2基因扩增的肽核酸探针)、用于定性检测AXIN2基因突变的引物。本专利技术的原理是通过构建与AXIN2基因野生型互补的一段肽核酸PNA序列，当肽核酸PNA序列与AXIN2基因互补结合时，任一突变均可导致PNA/DNA产生错配，从而使得溶解温度发生改变。进而根据AXIN2基因突变型设计特异性的肽核酸PNA探针以及引物对AXIN2突变型基因进行荧光定量PCR扩增，经过一轮的PCR扩增后，即可将AXIN2基因突变型与野生型进行区分开来。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：用于轴抑制蛋白(AXIN2)基因P435Q突变检测的试剂盒，它包括以下引物及探针：用于特异性检测AXIN2基因P435Q突变的正向引物AXIN2-F：5'-gaagagagagagggctccg-3'；用于特异性检测AXIN2基因P435Q突变的反向引物AXIN2-R：5'-cgtctgcttggtcacaaagc-3'；用于特异性检测AXIN2基因P435Q突变的肽核酸荧光探针AXIN2-PNA-P：5'-荧光报告基团-ggaagaccagcagacgatac-淬灭基团-3'；用于阻断野生型AXIN2基因扩增的肽核酸探针AXIN2-PNA：5'-ggaagacccgcagacgatac-3'。进一步地，所述的试剂盒还包括：检测内参的正向引物AXIN2-F'：5'-ccaccattcgcagtaccac-3'；检测内参的反向引物AXIN2-R'：5'-caaactgctcgctgggc-3'；检测内参的肽核酸荧光探针AXIN2-PNA-P'：5'-荧光报告基团-gatcgaggcggaggcca-淬灭基团-3'。进一步地，所述的试剂盒还包括PCR反应试剂。所述PCR的反应试剂包括：DEPC水、DNA聚合酶、dNTPs、PCRBuffer、RNASIN、逆转录酶、oligo(dT)和含Mg离子的溶液(MgCl2)等。所述的DNA聚合酶优选为具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶。进一步地，在具体检测时PCR反应体系中的各组分浓度如下：DNA聚合酶的终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL，dNTPs的终浓度为0.2～0.6mM，PCRBuffer的终浓度为1×，RNASIN的终浓度为40U/μL～60U/μL，M-MLV逆转录酶的终浓度为200U/μL～320U/μL，Mg离子(MgCl2)的终浓度为1.5～5.0mM，正向引物的终浓度为0.05～0.9μM，反向引物的终浓度为0.05～0.9μM，oligo(dT)的终浓度为0.05～0.9μM，肽核酸探针的终浓度为0.05～0.9μM，肽核酸荧光探针的终浓度为0.05～0.9μM。进一步地，所述的试剂盒还包括阳性对照品、阳性参考品及阴性参考品。所述的阳性对照品为含有AXIN2基因第6外显子P435Q突变的质粒DNA与含有AXIN2基因第7外显子序列的质粒DNA的混合物，浓度3ng/μL。所述的阳性参考品为含有AXIN2基因第6外显子P435Q突变的质粒DNA，阴性参考品为含有AXIN2基因第6外显子P435野生的质粒DNA，浓度为3ng/μL。本专利技术经过大量试验、研究和分析成功研究出能够用于快速、灵敏、有效的检测AXIN2基因P435Q突变的试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于AXIN2基因P435Q突变检测的试剂盒，其特征在于：包括引物和肽核酸探针，所述的引物包括用于特异性检测AXIN2基因P435Q突变的正向引物AXIN2‑F和反向引物AXIN2‑R，所述的肽核酸探针包括用于特异性检测AXIN2基因P435Q突变的肽核酸荧光探针AXIN2‑PNA‑P和用于阻断野生型AXIN2基因扩增的肽核酸探针AXIN2‑PNA，所述引物、肽核酸探针的序列如下：AXIN2‑F：5'‑gaagagagagagggctccg‑3'；AXIN2‑R：5'‑cgtctgcttggtcacaaagc‑3'；AXIN2‑PNA‑P：5'‑荧光报告基团‑ggaagaccagcagacgatac‑淬灭基团‑3'；AXIN2‑PNA：5'‑ggaagacccgcagacgatac‑3'。

【技术特征摘要】
1.用于AXIN2基因P435Q突变检测的试剂盒，其特征在于：包括引物和肽核酸探针，所述的引物包括用于特异性检测AXIN2基因P435Q突变的正向引物AXIN2-F和反向引物AXIN2-R，所述的肽核酸探针包括用于特异性检测AXIN2基因P435Q突变的肽核酸荧光探针AXIN2-PNA-P和用于阻断野生型AXIN2基因扩增的肽核酸探针AXIN2-PNA，所述引物、肽核酸探针的序列如下：AXIN2-F：5'-gaagagagagagggctccg-3'；AXIN2-R：5'-cgtctgcttggtcacaaagc-3'；AXIN2-PNA-P：5'-荧光报告基团-ggaagaccagcagacgatac-淬灭基团-3'；AXIN2-PNA：5'-ggaagacccgcagacgatac-3'。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包括PCR试剂。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：包括阳性对照品、阳性参考品及阴性参考品。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照品为含有AXIN2基因第6外显子P435Q突变的质粒DNA与含有AXIN2基因第7外显子序列的质粒DNA的混合物。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的阳性参考品为含有AXIN2基因第6外显子P435Q突变的质粒DNA，阴性参考品为含有A...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐景峰，陈兴珍，周策凡，胡苗，钱学红，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42