一种肺癌EGFR L858R和19Del的ddPCR检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及医学和生物技术领域，具体涉及一种肺癌EGFR L858R和19Del的ddPCR检测方法及应用，检测方法包括对外周血的血细胞和血浆分离、采用两步纯化法进行cfDNA的提取、针对肺癌相关的EGFR L858R位点和EGFR 19号外显子缺失位点分别设计2个探针和1对引物、以提取的cfDNA为模板进行ddPCR检测、最后对获得的扩增产物进行数据分析，获得EGFR敏感性突变L858R和19Del的比例；应用包括在肿瘤患者治疗中的应用，在肺癌晚期治疗过程中，针对肺癌患者提供用药相关基因位点突变信息，为肺癌个体化精准用药指导、药效评估以及疗效监测提供了重要的参考依据。

The ddPCR detection method and application of a lung cancer EGFR L858R and 19Del

The present invention relates to the field of medical and biological technology, in particular relates to a ddPCR detection of lung cancer EGFR L858R and 19Del methods and applications, including the detection method of peripheral blood cells and blood plasma separation, the two step extraction and purification method of cfDNA for lung cancer EGFR L858R site and EGFR exon 19 deletions of 2 probes were designed and 1 primer pairs, with the extracted cfDNA as template for ddPCR detection, finally the PCR products obtained for data analysis, EGFR L858R and 19Del sensitive mutation ratio; applications include applications in cancer patients in the treatment of advanced lung cancer, in the treatment process, to provide patients with lung cancer drug related gene mutation information, provides an important reference for lung cancer individualized accurate medication guidance, efficacy evaluation and therapeutic monitoring.

【技术实现步骤摘要】
一种肺癌EGFRL858R和19Del的ddPCR检测方法及应用
本专利技术涉及医学和生物
，具体涉及一种肺癌EGFRL858R和19Del的ddPCR检测方法及应用。
技术介绍
肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故亦称支气管肺癌。近50多年来，世界各国特别是工业发达国家，肺癌的发病率和死亡率均迅速上升，是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，5年生存率仅为16.8％，每年新确诊肺癌患者达到160万，肺癌同时也是癌症患者死亡的首要病因，每年有140万人口死于肺癌。目前，传统的肺癌治疗方式有：外科手术治疗、放疗和化疗等。外科手术治疗虽然可以切除肿瘤，但是手术过程中可能无法完全切除或引起肿瘤转移，还可能造成器官损伤及身体免疫力降低；化疗是一种全身性的治疗，效果明显和迅速，但是在杀伤肿瘤细胞的同时也可能会把正常细胞一起杀灭，所以，化疗算得上是一种“玉石俱焚”的治疗方法；放疗在某些肿瘤方面可以达到手术切除的效果，但放疗成本高，周期长，并发症也较多。靶向治疗作为一种新兴治疗手段，由于其毒性小，副作用少并且能够大大提升患者生存周期以及生活质量而得到广泛的应用。然而靶向药物的选择依赖于患者的基因分型，靶向药物往往有其对应的靶基因，当该基因发生突变时某条调控细胞增殖分裂的信号通路被持续激活，或者是调控细胞凋亡的信号通路被抑制，当使用相应的靶向药物之后，该通路被阻断，肿瘤细胞被杀死。因此针对肺癌的靶基因以及其驱动基因的检测技术的开发是应用靶向治疗的基础。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是靶向治疗的重要作用靶点，目前针对EGFR的靶向药物包括EGFR抗单克隆抗体药爱必妥、帕尼单抗，以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂易瑞沙和特罗凯。其中，针对酪氨酸激酶抑制剂靶向药物的使用还要参照EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变，最常见的敏感性突变包括EGFRL858R突变和EGFR19Del。这些突变使患者对EGFR-TKI(tyrosinekinaseinhibitor，酪氨酸激酶抑制剂)敏感，对肺癌患者靶向药物的选择具有指导意义，如果野生型患者采用EGFR-TKI治疗，会增加41％疾病进展风险的概率。因此，检测EGFR基因突变情况，筛查获益人群，将大大提高药物的效率并节约资源。肿瘤的治疗效果与肿瘤的早期发现有很大的关系，由于肺癌肿瘤细胞倍增时间短、进展快，非小细胞肺癌患者中，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低，因此肺癌检出越早越有利于治疗，因此研发一种为肺癌早期诊断提供参考信息的检测技术迫在眉睫。循环肿瘤DNA(ctDNA)，是一类具备广泛应用前景的肿瘤标志物，可用于基因分型和肿瘤发展状态及预后的无创检测。CtDNA是游离DNA(cell-freeDNA，cfDNA)的一种，最早应用于产前胎儿性别的判断和筛查唐氏综合征等发育性疾病。但是存在于外周血液中的游离DNA与癌症关系的理解十分缓慢，原因是ctDNA在血液中的含量非常少且极为多变。随着肿瘤的疾病进展，ctDNA在血液中的含量也随之升高，液体活检技术在超早期就能对血液中含有的极微量的ctDNA进行捕获测序，为肿瘤早期诊断及相关突变提供参考依据，这对癌症的早期发现是一次革命性的进步。现有的EGFR基因方法主要包括QPCR、一代测序、FISH、IHC等。但是，这些方法检测步骤繁琐，且敏感度低，而且针对FISH以及IHC的检测结果还需要有经验的技术人员进行鉴定。近几年来，液体活检出现在公众的视野之中，《ASCO年度报告：2015临床肿瘤学进展》中，液体活检技术被列为肿瘤治疗领域下一个十年趋势之一，可以实现稀有变异和拷贝数变异的检出，灵敏度高。针对现有的肺癌检测方法存在如下缺陷与不足：第一，传统检测优化方法主要依靠技术人员的经验进行结果判读，不能直接、客观、准确反映检测结果，也不能对DNA进行绝对定量；第二，现有的基于肺癌EGFRL858R和19Del的检测优化方法，通常对样本的cfDNA总量和质量要求高，容易受大量血缘DNA以及反应抑制剂的影响；第三，现有的基于肺癌EGFRL858R和19Del的检测优化方法检测步骤繁琐，且检测灵敏度低，会存在一定量的假阳性检测结果，尤其是血浆样本中cfDNA假阳性检出率更高，因为cfDNA主要是来源于胚系起源的良性细胞，ctDNA占比相对低很多；第四，有文献资料显示在cfDNA提取过程中加入carrierRNA并不能促使cfDNA提取总量增加，很有可能会使gDNA大片段聚沉。第四，液体活检步骤繁琐，周期较长，成本高，不适合单个或2个位点的检测。综上，基于循环肿瘤DNA检测技术现已成为焦点，但是本领域还是缺乏低投入、高灵敏度、高准确性的突变DNA检测技术来检测肺癌EGFRL858R和19Del。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提出一种低投入、高灵敏度、高准确性的肺癌EGFRL858R和19Del的ddPCR检测方法及应用。所采用的技术方案为：一种肺癌EGFRL858R和19Del的ddPCR检测方法，包括如下步骤：(1)提供肺癌患者外周血样本，对所提供的外周血样本进行血细胞和血浆分离；(2)对分离获得的血浆样本采用两步纯化法进行cfDNA的提取，获得cfDNA提取物；(3)针对肺癌相关的EGFRL858R位点设计2个探针如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示、和1对引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；针对肺癌相关的EGFR19号外显子缺失位点设计2个探针如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示、和1对引物如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；(4)以提取的cfDNA为模板，进行ddPCR检测，获得含有敏感性突变位点的扩增产物；(5)对获得的扩增产物进行数据分析，获得EGFR敏感性突变L858R和19Del的比例。本专利技术采用针对肺癌EGFRL858R位点和EGFR19Del区域分别设计的1对引物和2条荧光探针对微量cfDNA进行PCR扩增和检测，然后对探针荧光信号值进行数据分析，获得准确的EGFRL858R和EGFR19号外显子19Del信息。本专利技术的肺癌EGFRL858R和EGFR19Del的检测方法，其检测结果，仅用于分析和判断靶标基因的突变信息，并为肺癌患者治疗和用药指导提供可靠的分析依据。本专利技术针对EGFR21号外显子L858R突变位点上下游特定区域，设计特异性高的长度分别为22bp和24bp的1对PCR引物；针对突变型和野生型EGFRL858R位点设计了特异性高的突变型检测探针和野生型检测探针，长度为16bp。本专利技术针对EGFR19号外显子缺失突变上下游特定区域，设计了特异性高的长度分别为22bp和18bp的1对PCR引物；针对突变型和野生型EGFRL858R位点设计了特异性高的突变型检测探针和野生型检测探针，长度分别为21bp，18bp。本专利技术ddPCR检测方案以血浆/血清中提取的cfDNA为模板，进行PCR扩增，对PCR循环数和退火温度进行优化，能够在cfDNA低投入量的情况下检出EGFRL858R和19Del低频突变，为肺癌患者的靶向治疗方案制定提供了重要的参考依据。优选的，步骤(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺癌EGFR L858R和19Del的ddPCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提供肺癌患者外周血样本，对所提供的外周血样本进行血细胞和血浆分离；(2)对分离获得的血浆样本采用两步纯化法进行cfDNA的提取，获得cfDNA提取物；(3)针对肺癌相关的EGFR L858R位点设计2个探针如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示、和1对引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；针对肺癌相关的EGFR 19号外显子缺失位点设计2个探针如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示、和1对引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；(4)以提取的cfDNA为模板，进行ddPCR检测，获得含有敏感性突变位点的扩增产物；(5)对获得的扩增产物进行数据分析，获得EGFR敏感性突变L858R和19Del的比例。

【技术特征摘要】
1.一种肺癌EGFRL858R和19Del的ddPCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提供肺癌患者外周血样本，对所提供的外周血样本进行血细胞和血浆分离；(2)对分离获得的血浆样本采用两步纯化法进行cfDNA的提取，获得cfDNA提取物；(3)针对肺癌相关的EGFRL858R位点设计2个探针如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示、和1对引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；针对肺癌相关的EGFR19号外显子缺失位点设计2个探针如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示、和1对引物如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；(4)以提取的cfDNA为模板，进行ddPCR检测，获得含有敏感性突变位点的扩增产物；(5)对获得的扩增产物进行数据分析，获得EGFR敏感性突变L858R和19Del的比例。2.根据权利要求1所述的肺癌EGFRL858R和19Del的ddPCR检测方法，其特征在于，步骤(1)中，抽取肺癌患者外周血，4h内进行血浆和血细胞的分离，血浆和血细胞分离的方法包括如下步骤：1)外周血样本1600g，离心外周血10min，分离为血细胞和血浆(上清液)，血细胞于-80℃保存；2)血浆样本进行第二次离心，16000g离心10min，移取上清液转并移至保存管中，置于-80℃保存。3.根据权利要求1所述的肺癌EGFRL858R和19Del的ddPCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中，采用两步纯化法抽提血浆cfDNA，抽提过程中不加入carrierRNA。4.根据权利要求3所述的肺癌EGFRL858R和19Del的ddPCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中，两步纯化法为：第一次采用异丙醇沉淀cfDNA，去除杂质，第二次采用无水乙醇沉淀cfDNA，去除杂质之后，去离子水进行洗脱，洗脱液即为所需的cfDNA模板。5.根据权利要求1所述的肺癌EGFRL858R和19Del的ddPCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，是针对野生型和突变型...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘园园，王一杏，张晓妮，
申请(专利权)人：深圳海普洛斯医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44