一种鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物及方法技术

一种鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物及方法，所述分子标记引物的引物序列为：L5979：5’‑TTTAGTATTCGGAGCCTGAG‑3’；H6241：5’‑CCTCAACACCTGATGAGGCC‑3’；所述的方法包括：提取多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于1%；所述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，rTaq 0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul；所述的PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。

Molecular marker primer and method for identification of sillagio sihama cryptice and sillagio sihama.

Molecular marker primer and method for identification of sillagio sihama cryptice and sillagio sihama, primer sequences of the molecular marker primer: L5979:5 TTTAGTATTCGGAGCCTGAG '3'; 'CCTCAACACCTGATGAGGCC 3' H6241:5; the method comprises the following steps: extracting sillagio sihama cryptice and sillagio sihama. DNA, with two species of DNA as template for PCR amplification, purification and sequencing of amplified results, comparing the results of sequencing, intraspecific genetic variation is less than 1%; the PCR amplification reaction system composed of ultrapure water: 17.5ul, 10 * buffer 2.5ul, dNTPs 2ul, rTaq 0.15ul, DNA template 1ul Primer, the 1ul; the PCR procedure is 94 DEG 5min and 94 DEG C pre degeneration, degeneration of 45sec, annealed at 50 C 45sec, C 45sec 72 extension, 35 cycles, the last 72 degrees extension 10min, 4 DEG C for preservation.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物及方法
本专利技术涉及一种鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物及方法，属于分子生物

技术介绍
多鳞鱚隐存种发现于巴基斯坦近海，隶属于鲈形目、鲈亚目、鱚科、鱚属。其外部形态与多鳞鱚极为相似：体呈长圆柱形，略侧扁，口小，开于吻端，上下颌和锄骨上有带状细齿，但口盖骨、腭骨及舌上均无齿。主鳃盖骨小，有一短棘；前鳃盖骨后缘垂直，平滑或略有锯齿，下缘水平。鳃膜在头侧与另一侧会合。体被小形栉鳞，鳞片易脱落；颊部具鳞2列，皆为圆鳞；侧线完全，呈单一列，略弯曲，侧线鳞数66-72；第一背鳍具XI硬棘；第二背鳍I硬棘，20-23软条。臀鳍有II弱棘，21-23软条，与第二背鳍相对；腹鳍正常，其外缘硬棘不鼓起；尾鳍后缘截平或浅凹；脊椎骨数为34。头部至体背侧土褐色至淡黄褐色，腹侧灰黄色，腹部近于白色。多鳞鱚隐存种为巴基斯坦近海重要的经济鱼种。其肉质细腻鲜美，具有很高的食用价值。目前用于鉴定巴基斯坦多鳞鱚隐存种的方法还没有见正式报道；由于二者形态非常相似，仅凭借形态特征很难将两者区分，因此寻找区分多鳞鱚隐存种和多鳞鱚的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题；这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种方法操作简单，易于掌握，准确性高，有助于解决鱚属鱼类种质混杂问题的鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物及方法。本专利技术的目的是通过如下技术方案来实现的：一种鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物，所述引物序列为：L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’。一种利用所述分子标记引物进行鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的方法，所述的方法包括：提取多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于1%；所述多鳞鱚隐存种的分子标记序列为：CAGGCATGGTGGGCACGGCCCTGAGCTTGCTAATCCGAGCAGAACTCAGCCAGCCCGGCGCTCTACTCGGTGATGACCAGATTTATAATGTTATTGTCACTGCACATGCTTTCGTAATGATTTTCTTTATAGTAATACCAATCCTCATCGGAGGATTTGGGAACTGACTCGTACCCCTAATGATTGGGGCCCCCGACATAGCATTCCCACGAATGAATAACATGAGCTTCTGACTTCTCCCTCCTTCTTTCCTTCTTCTTTT；所述多鳞鱚的分子标记序列为：CAGGTATGGTGGGCACGGCCCTAAGCCTGCTTATCCGAGCAGAACTTAGCCAACCTGGCGCTCTGCTTGGTGACGACCAAATTTACAATGTCATTGTCACCGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATCCTTATCGGAGGGTTCGGCAACTGGCTTGTTCCCCTGATGATCGGAGCCCCTGATATGGCATTCCCACGAATGAATAACATGAGCTTCTGACTCCTTCCTCCTTCTTTCCTCCTTCTCTT。本专利技术所述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer2.5ul，dNTPs2ul，rTaq0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul；所述的PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。本专利技术与现有技术相比的有益效果：由多鳞鱚隐存种和多鳞鱚mtDNACOI基因262bp序列排序结果可以看出多鳞鱚隐存种与多鳞鱚存在35个碱基的差异，表现为3个颠换，32个转换；其结果稳定，可重复性强；30尾多鳞鱚隐存种个体（巴基斯坦群体）的扩增结果一致，表现出高度的一致性，因此基于COI基因的碱基差异可以作为多鳞鱚隐存种和多鳞鱚的种质区分的分子标记；同时，鉴别方法简单。具体实施方法下面通过实施例来对本专利技术的技术方案作进一步解释，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。一种鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物，所述引物序列为：L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’。一种利用所述分子标记引物进行鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的方法，所述的方法包括：提取多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于1%；所述多鳞鱚隐存种的分子标记序列为：CAGGCATGGTGGGCACGGCCCTGAGCTTGCTAATCCGAGCAGAACTCAGCCAGCCCGGCGCTCTACTCGGTGATGACCAGATTTATAATGTTATTGTCACTGCACATGCTTTCGTAATGATTTTCTTTATAGTAATACCAATCCTCATCGGAGGATTTGGGAACTGACTCGTACCCCTAATGATTGGGGCCCCCGACATAGCATTCCCACGAATGAATAACATGAGCTTCTGACTTCTCCCTCCTTCTTTCCTTCTTCTTTT；所述多鳞鱚的分子标记序列为：CAGGTATGGTGGGCACGGCCCTAAGCCTGCTTATCCGAGCAGAACTTAGCCAACCTGGCGCTCTGCTTGGTGACGACCAAATTTACAATGTCATTGTCACCGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATCCTTATCGGAGGGTTCGGCAACTGGCTTGTTCCCCTGATGATCGGAGCCCCTGATATGGCATTCCCACGAATGAATAACATGAGCTTCTGACTCCTTCCTCCTTCTTTCCTCCTTCTCTT。本专利技术所述PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer2.5ul，dNTPs2ul，rTaq0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul；所述的PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。实施例1：选用巴基斯坦多鳞鱚隐存种与福建晋江沿海的多鳞鱚，提取2个样本群体的DNA，然后以所提取的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果；所述的引物序列为L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’；所述的PCR扩增的反应体系组成为：0.2ml离心管中依次加入：超纯水17.5ul10×buffer2.5uldNTPs2ulrTaq0.15ul模板1ulPrimer各1ul；PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物，其特征在于所述引物序列为：L5979：5’‑TTTAGTATTCGGAGCCTGAG‑3’；H6241：5’‑CCTCAACACCTGATGAGGCC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物，其特征在于所述引物序列为：L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’。2.一种利用权利要求1所述分子标记引物进行鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的方法，其特征在于所述的方法包括：提取多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于1%；所述多鳞鱚隐存种的分子标记序列为：CAGGCATGGTGGGCACGGCCCTGAGCTTGCTAATCCGAGCAGAACTCAGCCAGCCCGGCGCTCTACTCGGTGATGACCAGATTTATAATGTTATTGTCACTGCACATGCTTTCGTAATGATTTTCTTTATAGTAATACCAATCCTCATCGGAGGATTTGGGAACTGACTCGTACCCCTAATGATTGGGGCCCCCGACATAGCATTCCCACGAATGAATAACATGAGCTTCTGACTTCTCCCTCCTTCTTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：高天翔，陈治，韩志强，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33