一种肿瘤循环DNA甲基化检测引物制造技术

本发明专利技术提供了肿瘤循环DNA甲基化PCR检测引物、探针、阻断片段和试剂盒，以及检测肿瘤循环DNA甲基化的方法。本发明专利技术具有灵敏度高，特异性强、重复性好、操作简单、安全等优点，检测结果具有较高的精密度和重复性，对大肠癌的早期检测有一定的辅助诊断作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因检测领域，特别是涉及一种对肿瘤循环DNA甲基化检测引物。
技术介绍
肿瘤循环DNA(ctDNA)是人体血液循环系统中不断流动的、并具有某些特征(包括点突变、甲基化修饰异常、染色体的缺失、插入、重排和拷贝数异常等)的来源于肿瘤细胞基因组的DNA片段，属于游离核酸的一种，其主要来源包括：1、凋亡的肿瘤细胞；2、坏死的肿瘤细胞；3、循环肿瘤细胞；4、肿瘤细胞分泌的外排体。其含量约占整个循环DNA的0.01～1％，对血液中的肿瘤循环DNA进行检测，可作为肿瘤的早期诊断的生物标志物和预后评估指标，对肿瘤的普查、筛查和风险评估、早期诊断、分期分型及治疗监测都具有重要意义。肿瘤循环(ct-DNA)标本包括肿瘤细胞和或癌细胞死亡或者凋亡后释放到外周血循环中的肿瘤循环DNA，所述待测肿瘤循环(ct-DNA)标本来源于人类正常细胞、肿瘤细胞、癌细胞、血清游离DNA、血浆游离DNA、体液游离DNA或者排泄物细胞DNA和游离DNA。DNA甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生的一个重要因素，这些变化包括CpG岛局部的高甲基化和基因组DNA低甲基化状态。由于CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测，而全基因组水平的低水平甲基化状态，则随着肿瘤恶性程度的增加而进一步降低，使其可用于肿瘤的诊断以及分级。甲基化可作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。Septin基因家族至少由13个基因组成，它们编码保守的GTPase结构域，可以结合细胞骨架相关的蛋白质，这些蛋白质与肿瘤发生相关。Septin基因家族蛋白质的主要功能是胞质分裂、膜泡运输、膜融合、胞外分泌、细胞凋亡。Septin9基因通过选择性剪接有5种不同的转录本，其蛋白质涉及到许多细胞过程，Septin9行为异常将引起细胞不完整分裂。已有研究表明Septin9基因的第二种转录本启动子的甲基化和大肠癌的发生有关。由此可见，检测mSEPT9基因甲基化异常修饰可作为大肠癌早期诊断的一个生物标志物。目前，传统的甲基化检测方法包括：直接测序法(亚硫酸氢盐测序法)，专利申请CN104046686A采用此方法，原理是：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，PCR扩增后，尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断CpG位点是否发生甲基化。但此方法实验过程长，需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，实验检测的费用高。甲基化特异性PCR法，用重亚硫酸盐使胞嘧啶转化为尿嘧啶，进行引物设计(每个基因设计两对引物，分别为：甲基化引物M、非基因化引物U，对应扩增甲基化和非甲基化的目的片段)，有时需设计巢式引物；PCR扩增：对甲基化和非甲基化的目的片段分别进行扩增，此时应尽可能使用梯度PCR仪，同时使用不同的退火温度，以筛选到合适的退火温度；对PCR产物电泳。该方法检测时间相对较长，不能及时获得检测结果。甲基荧光法是基于Taqman荧光实时定量技术的甲基化检测技术。其过程如下：先用重亚硫酸盐处理待测DNA片段，设计一个能与待测位点区互补的探针，探针的5'端连接报告荧光，3'端连接淬灭荧光，随后一般采用MSP引物进行实时定量PCR。Methylight法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后再进行电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。但该方法多为单重PCR检测，没有内参基因的扩增，不能确保模板DNA的硫化修饰质量。专利申请CN103732759A提到可以使用甲基化特异性PCR法和甲基荧光法，但是其通过测量Septin9、甲基化RASSF2A和HB14基因的三重测定方法测定Septin9和甲基化RASSF2A的水平。可以以单重、二重、三重、四重或多重(multiplex)方式进行类似的测定。其方法既操作繁琐也没有显示具体可行的实验结果，限制了其在临床实验室的广泛应用。甲基化敏感性解链曲线分析法是将PCR扩增和溶解曲线分析结合在一起，由于目的片段的微小序列差异引起PCR溶解温度的改变，从而可以对基因突变、基因分型、基因甲基化等进行检测。国内专利申请CN104164516A即采用此方法。但该方法需要不同甲基化程度的标准品，实验结果读取复杂繁琐。并且该方法用的荧光染料为饱和荧光染料，结果只能检测一个荧光信号通道，不能同时分析样本内参基因的扩增情况，不能推断硫化修饰的效果，容易出现重亚硫酸盐处理不完全的问题以及假阴性。甲基化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitiverestrictionEndonuclease，MS-RE法)。这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析。缺点是：1.由于CG不仅仅限于CCGG序列中，因此非该序列中的CG将被忽略；2.只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时,该检测方法的结果才有意义；3.相对而言，Southern方法较复杂，且需要样本的量大；4.存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题；5.不适用于混合样本。总之，目前肿瘤循环DNA甲基化检测技术由于提取游离核酸的回收率不高，区分基因位点CpG岛甲基化修饰技术的局限性和后续荧光定量PCR检测ctDNA标本低浓度(50pg以下)低纯度、高背景的非靶点DNA(100倍)等原因，导致目前检测灵敏度50％左右，特异性75％左右并且检测重复性不高。而甲基化程度的检测结果并不能直接诊断结直肠癌或大肠癌，必须结合有效的对检测结果进行判断分析的方法才能对结直肠癌或大肠癌进行有效诊断。开发出特异性和灵敏地扩增目标区域含甲基化DNA片段的方法是进行后续癌症早期诊断的前提之一。要特异性和灵敏地扩增目标区域含甲基化DNA片段，对于开发能够特异性和灵敏地扩增目标区域含甲基化DNA片段的引物是关键之一。目前，尽管对于Septin基因的序列已经知道，但是如何找到影响基因转录的CpG甲基化位点并设计出能够特异性识别该位点且能够有效应用于相应的检测方法的引物仍然是本领域技术人员面临的难题。在甲基化特异性PCR检测中，一个重要的环节是阻断片段的选择，阻断片段在PCR扩增反应的退火阶段发挥作用，其能够阻断未甲基化修饰DNA序列扩增，目前的阻断片段的选择通常基于经验，但是本专利技术人基于特殊算法设计开发出的阻断片段能有效保证特定甲基化修饰DNA序列的扩增，阻断其他多种可能的未甲基化或者不完全甲基化修饰DNA序列的扩增，从而完成本专利技术可有效区分检测靶点与非靶点序列。本申请的专利技术人针对特定的CpG甲基化位点开发了特异性引物和简单有效的PCR检测方法，同时，精确调整PCR反应体系中的引物和探针的用量，合理选择能够有效阻碍非靶点序列的扩增反应的阻断片段，以及能够非常灵敏且特异的检出靶点序列的探针可以进一步增加检测的灵敏度和特异性，确保能够在100倍以上的背景非靶点中检出浓度低于50pg/反应靶点序列，例如本专利技术实施例中所用的阳性质控品PC即为此类标本，其甲基化修饰异常DNA含量小于1％，背景DNA即未发生甲基化修饰异常的DNA含量大于99％，相对灵敏度高于100：1。目本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PCR检测引物，其特征在于，所述引物序列为

【技术特征摘要】
1.一种PCR检测引物，其特征在于，所述引物序列为2.一种PCR检测探针，其特征在于，所述探针序列为3.一种PCR检测阻断片段mS9-B，其特征在于，阻断片段mS9-B序列为4.一种肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，其包括实施方案1的引物和/或权利要求2的探针和/或权利要求3的阻断片段，优选所述的阻断片段存在3`端修饰，更优选所述3`端修饰为：磷酸化处理、脱羟基化处理或者间臂：C3Spacer、C6Spacer、C12Spacer。5.如权利要求4所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒还包括内参基因的引物、探针，优选所述的内参基因为ACTB(Beta-actin)，更优选内参基因ACTB的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R、探针ACTB-P的序列如下：名称序列ACTB-FgaggaggtttagtaagttACTB-RccaataaaacctactcctACTB-Pacccaacacacaataaca进一步优选地，所述的靶基因和内参基因的探针的5`端报告荧光基团为FAM、JOE、TAMRA、HEX、TexasRed、Cy3、Cy5中的一种或者多种，所述靶基因和内参基因的探针的3`端猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一种或者多种。6.一种肿瘤循环DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述方法包括(1)对待测肿瘤循环(ct-DNA)标本进行亚硫酸氢盐修饰处理；(2)将处理后的待测肿瘤循环(ct-DNA)标本、靶基因引物、靶基因探针、内参基因、内参基因引物和探针进行荧光定量PCR反应；(3)测量所述待测肿瘤循环(ct-DNA)标本、阳性质控...

【专利技术属性】
技术研发人员：李旭辉，张雷，郭书娟，李阳，杨永臣，
申请(专利权)人：敬善生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31