本发明专利技术公开了用于检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物，EmbB 233‑F和EmbB 233G‑R是检测EmbB基因A233G突变的特异性引物，EmbB 233‑F和EmbB 233A‑R是检测野生型菌株EmbB基因的特异性引物，16S 915‑F和16S 1018‑R为内参引物；本发明专利技术引物具有快速、简单、经济、准确、灵敏的特点，仪器设备要求不高，适合于在大规模的临床样本检测中推广应用；对结核分枝杆菌耐药性研究中具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了一种用于快速检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物组，属于耐药结核分支杆菌突变
技术介绍
结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病，主要是结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染导致。据WHO统计，结核分枝杆菌感染是传染病界的头号杀手，全球现有结核病患者约2000万，其中90%左右为肺结核患者。2014年，儿童约有100万结核病患者，约14万死亡病例。由此可见，结核病的发生和传染对全球社会和经济造成了严重的影响。近年来由于抗结核药物的长期使用及滥用，导致耐药结核菌的产生。分为单耐药结核、多耐药结核（MDR-TB，Multidrug-resistantTB）和泛耐药结核（XDR-TB，Extensivelydrug-resistantTB），单耐药结核菌指针对单一药物耐受，多耐药结核为至少对异烟肼（Isonicotinicacidhydrazide，INH）、利福平（Rifampicin，RFP）耐药，泛耐药结核为至少对两种主要一线抗结核药物异烟肼、利福平耐药外，还对任何氟喹诺酮类（Quinolones）抗生素产生耐药，以及三种二线抗结核注射药物中的至少一种耐药。目前研究表明，结核分枝杆菌基因突变是其产生耐药性的主要原因。乙胺丁醇（Ethambutol，EMB）与异烟肼、利福平、吡嗪酰胺（Pyrazinamide，PZA）等属于一线抗结核药物，常联用治疗结核病。该药物可干扰细胞壁阿拉伯半乳聚糖的合成，抑制细胞壁阿拉伯聚糖层阿拉伯半乳聚糖和脂质阿拉伯甘露聚糖的聚合作用，诱导D-阿拉伯呋喃糖残基的积累。已经证实结核分枝杆菌EmbB基因突变可导致乙胺丁醇耐药，该基因全长3285bp，编码阿拉伯糖基转移酶主要成分（阿拉伯糖基转移酶编码基因Emb操纵子由EmbA、EmbB、EmbC三部分组成）。Brossier等发现EmbB基因的306（A916G、A916T、G918S和G918C）和406（G1217C）位氨基酸突变，改变了所编码酶的结构，由此产生耐药。EmbB基因第78位密码子（A233G）突变是我们新发现的耐乙胺丁醇的突变，之前没有相关报道。目前市场上已有的结核分枝杆菌耐乙胺丁醇药物突变检测试剂盒所用方法与本专利技术不同，这些试剂盒均以荧光定量PCR技术或一代测序技术为基础，无论仪器还是试剂，均比普通PCR使用成本高出很多，不适合在常规的实验室及医院中推广使用。等位基因特异PCR（Allele-specificPCR，AS-PCR）方法操作简便、快速，所需实验器材简单，实验试剂经济，因此该方法被广泛的应用于DNA突变或单核苷酸多态性（SNP）的检测。本专利技术不仅提供了简便、快速、经济的突变检查方法，还增加了突变的检查范围。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速、简易、经济的检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的AS-PCR特异性引物，其中EmbB233-FEmbB233G-R是检测EmbB基因A233G突变的特异性引物，EmbB233-F和EmbB233A-R是检测野生型菌株EmbB基因的特异性引物，16S915-F和16S1018-R为内参引物，引物序列如下：；该方法基于AS-PCR的原理，将检测突变型引物中的反向引物的3′端设计为C，并且在引物3′端第二位引入一个错配碱基（将碱基G突变成碱基A，形成A/C错配），以增强引物对突变DNA模板扩增的特异性，为确定突变是纯合突变或杂合突变，同时用一对检测野生型样本的引物进行检测，将检测野生型引物中的反向引物的3′端第四位引入一个错配碱基（将碱基A突变成碱基G，形成G/T错配）；同时，在结核分枝杆菌16SrRNA的相对保守的区域中的915-1018区段还设计了一对内参引物（见上表，16S915-F/1018-R），用于监测PCR扩增反应体系是否合适及反应是否正常进行扩增。采用上述2对AS-PCR引物（EmbB233-F/233G-R和EmbB233-F/233A-R）及一对内参引物对待测标本DNA进行PCR扩增。设计检测突变的引物只能扩增出含有突变的样本，不能扩增出野生型的样本；而设计检测野生型的引物，只能扩增出野生型的样本，不能扩增出含有突变的样本，并且无论样品中是否包含突变，均加入内参引物16S915-F/1018-R，这样就避免了由于PCR失败而造成的假阴性的检测结果。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测，依据能否扩增出目的片段来实现基因突变简便、快速的检测。为确定AS-PCR方法检测耐乙胺丁醇突变的特异性和灵敏度，选取14个野生型样本及所有突变型样本进行引物特异性检测，同时对所有突变位点构建了阳性质粒，对不同拷贝数的阳性质粒进行扩增，以确定其灵敏度，并提供本技术检测到的最低水平的突变DNA的技术参数。本专利技术利用等位基因特异PCR（Allele-specificPCR，AS-PCR）方法检测结核分枝杆菌在EmbB233位突变位点，具体步骤如下：（1）DNA提取：使用试剂盒法从结核分枝杆菌临床分离株中提取基因组DNA；（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应；PCR反应引物：扩增引物序列及产物大小见上表；PCR反应体系：总体系为20µL，包含30ng基因组DNA，10µL2×TSINGKETMMasterMix，AS-PCR引物和内参引物中的正反向引物各0.5µM，余下用ddH2O补齐；PCR反应程序：95℃，预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸10s，重复35个循环；72℃延伸5min。（3）PCR产物检测：取PCR产物2.5µL在2%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，120V恒压电泳30min，凝胶成像系统下观察拍照。（4）灵敏度检测使用构建成功的阳性质粒作为模板，设置三个梯度（即3000、104和105个拷贝）用以检测出本技术所能检测到的最低水平的突变DNA的技术参数，并且使用106个拷贝作为阳性对照；按照与步骤（2）和（3）相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。（5）特异性实验本专利技术为了验证AS-PCR引物的特异性，随机的选择了14个野生型样本对突变型AS-PCR引物进行测试，并用野生型AS-PCR引物对所有突变型样本进行检测；并且在进行每一个特异性试验中我们都加入了内参；将模板按照与步骤（2）和（3）相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。本专利技术与其它现有技术相比，具有快速、简单、经济、准确、灵敏的特点，仪器设备要求不高，适合于在大规模的临床样本检测中推广应用；本专利技术对于结核分枝杆菌耐药性研究中具有重要意义。附图说明图1为本专利技术方法的灵敏度检测电泳图谱；图2为本专利技术方法的特异性实验电泳图谱。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。1、引物设计基于AS-PCR的原理，将检测突变型引物中的反向引物的3′端设计为C，并且在引物3′端第二位引入一个错配碱基（将碱基G突变成碱基A，形成A/C错配），以增强引物对突变DNA模板扩增的特异性，为确定本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物，其中EmbB 233‑F和EmbB 233G‑R是检测EmbB基因A233G突变的特异性引物，EmbB 233‑F和EmbB 233A‑R是检测野生型菌株EmbB基因的特异性引物，16S 915‑F和16S 1018‑R为内参引物，引物序列如下：。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物，其中EmbB233-F和EmbB233G-R是检测EmbB基因A233G突变的特异...
【专利技术属性】
技术研发人员：张阿梅，宋玉竹，夏雪山，杨鹏鹏，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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