本发明专利技术公开了一种菌影载体ＰＭＡＬ－Ｅ－ＳＮ的构建及其在大肠杆菌中的应用，以ＰｈｉＸ１７４噬菌体ＲＦＩ质粒为模板进行ＰＣＲ扩增，得到Ｅ基因；以金黄色葡萄球菌标准株ＡＴＣＣ２５９２３基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，得到ＳＮ基因；用十五个柔性氨基酸的Ｌｉｎｋｅｒ串连Ｅ基因和ＳＮ基因，得到Ｅ－ＳＮ基因；Ｅ－ＳＮ基因ＰＣＲ扩增产物与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，筛选阳性质粒ｐＴ－Ｅ－ＳＮ测序；用质粒载体ＰＭＡＬ－ｐ２Ｘ和测序正确的重组质粒ｐＴ－Ｅ－ＳＮ构建菌影载体ＰＭＡＬ－Ｅ－ＳＮ。本发明专利技术的菌影载体ＰＭＡＬ－Ｅ－ＳＮ通过“ｔａｃ”强启动子和ｍａｌＥ翻译起始信号使Ｅ基因和ＳＮ基因获得高效表达，成功制备了大肠杆菌菌影，裂解效率可达９９．９９％；本发明专利技术引入次要杀伤基因ＳＮ，并联合Ｅ基因和ＳＮ基因连入高效表达载体ＰＭＡＬ－ｐ２Ｘ，取得了良好的效果，可广泛应用于大肠杆菌菌影的制备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用E基因和SN基因构建菌影载体PMAL-E-SN的方法，本专利技术 还涉及菌影载体PMAL-E-SN在制备大肠杆菌菌影中进行应用，属于基因工程领域。
技术介绍
菌影(bacterial ghost,BG)是一种新型的疫苗及佐剂形式，其实质是一种不含胞浆及 核酸等内容物的空细胞体，它最大的特点是保留了和活菌一样的完整内外膜结构，能 够有效刺激机体产生特异性和非特异性免疫应答，抵抗病原微生物的侵袭。相对于传 统灭活疫苗来说，它的表面抗原结构得到最大程度的保留，免疫原性高，较之新型疫 苗又兼有疫苗和佐剂的双重作用，并可在其内部及外膜上负载外源抗原，成为优良的 抗原递送载体，同时为联合疫苗的研究提供研究平台，在致病性微生物越来越难以控 制的今天，菌影系统开始受到国内外研究者的关注。噬菌体PhiX174的E基因编码一91个氨基酸的膜蛋白，它能融合革兰阴性菌内膜和 外膜，形成一种大小介于40 200nm的E特异性跨膜裂解通道。在渗透压的作用下，细 菌只剩下内外膜结构，其内部空间失去了核酸、核糖体和其他内容物。电镜显示周浆 间隙在裂解通道边缘被封闭，很可能是蛋白E作用后，胞膜上出现的溶磷脂酰乙醇胺使 内外膜融合。E基因ts或琥珀突变仅使裂解表型缺陷，感染Eam突变体(UAG在第4密码 子)的细胞停止分裂、细胞变长、丧失生存能力并且子代噬菌体可积累到正常释放水平 的10倍(仅有不到1%释放)。E蛋白占1/3的氨基端与入S蛋白有相似性。诱导克隆到有 lacI/cI阻遏蛋白表达载体的E基因表达可导致细胞裂解，形成空影细胞，也即菌影。金黄色葡萄球菌核酸酶A(Staphylococcus nucleaseA， SN)，又名微球菌核酸酶，是 由金黄色葡萄球菌分泌的一种胞外核酸非专一性磷酸二酯酶，对单链或双链DNA或 RNA均有较强的降解能力，其活性依赖于Ca2、 Mg^浓度。在制备菌影的过程中该核 酸酶在细菌胞浆内的聚集可将细菌DNA降解为100bp以下的小片段，有利于细菌内容物 的释放，提高细菌裂解率。葡萄球菌核酸酶A不仅为金黄色葡萄球菌所特有，而且在不 同菌株之间具有较高的保守性。在大肠杆菌中表达葡萄球菌核酸酶A能使胞内核酸酶蛋 白堆积，并将宿主DNA降解成100bp以下的短片段，但不会影响菌影的形成。该酶结构简单，仅由l条单肽链组成，长约149个氨基酸，不含半胱氨酸和二硫键，能够可逆地 去折叠和重折叠，是研究蛋白质结构与功能的关系，蛋白质折叠和动力学的重要模型。 同时，SN也是衣壳蛋白耙向病毒灭活(cap sidtargeted viral inactivation， CTVI)策略中应用最为广泛的抗病毒因子。目前在国内外在菌影制备方面已有很多成功的先例，但是一般菌影载体只应用E基 因，并且裂解效率很难提高。
技术实现思路
本专利技术公开一种菌影载体PMAL-E-SN，使E基因和SN基因获得高效表达。 本专利技术还提供了菌影载体PMAL-E-SN的构建方法，提高了制备大肠杆菌菌影的 裂解效率。本专利技术进一步提供了菌影载体PMAL-E-SN在制备大肠杆菌菌影中的应用。 本专利技术公开了利用菌影载体PMAL-E-SN制备大肠杆菌0138菌影的方法。本专利技术的菌影载体PMAL-E-SN,其特征在于由E基因、SN基因和质粒载体 PMAL-p2X组成。本专利技术的菌影载体PMAL-E-SN构建方法如下以PhiX174噬菌体RFI质粒为模板进行PCR扩增，得到E基因；以金黄色葡萄球 菌标准株ATCC25923基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到SN基因；用十五个柔 性氨基酸的Linker串连E基因和SN基因，得到E-SN基因；E-SN基因PCR扩增产物 与pMD18-T载体连接，筛选阳性质粒pT-E-SN测序；用质粒载体PMAL-p2X和测序 正确的重组质粒pT-E-SN构建菌影载体PMAL-E-SN。本专利技术的菌影载体PMAL-E-SN可以用于制备大肠杆菌菌影。利用菌影载体PMAL-E-SN制备的大肠杆菌0138菌影，包括以下步骤将菌影载 体PMAL-E-SN转化到肠杆菌TBI和0138中，构建包含菌影载体PMAL-E-SN的重组 菌株TBI和0138;将重组菌株37。C振荡培养至OD600=0.4时，加入终浓度为lmmoI/L 的IPTG进行诱导，37"C继续振荡培养4h，制备成大肠杆菌0138菌影。将本专利技术制备的大肠杆菌0138菌影免疫实验动物，可刺激机体产生抗0138的特 异性体液免疫和细胞免疫，与甲醛灭活苗相比有相同的保护率。本专利技术的积极效果在于本专利技术在E基因的基础上，引入次要杀伤基因SN，并联合E基因和SN基因连入 高效表达载体PMAL-p2X，构建成功了菌影载体PMAL-E-SN，取得了良好的效果，可4广泛应用于大肠杆菌菌影的制备。提高了制备大肠杆菌菌影的裂解效率，裂解效率可 达99.99%。 附图说明图1为菌影载体PMAL-E-SN的构建流程图； 图2、 3为大肠杆菌0138菌影TEM照片(13000X); 图4为间接ELISA检测血清IgG抗体水平。 具体实施例方式通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术，在不背离 本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任 何改动或改变都将落入本专利技术的权利要求范围之内。实验材料限制性内切酶、PhiX174噬菌体RFI质粒、pMD18T克隆载体购自Takara 公司，质粒载体载体PMAL-p2X购自New England Biolabs公司、金黄色葡萄球菌标准 株ATCC25923购自由中国药品生物制品鉴定所，致仔猪水肿病标准菌株0138购自中国 兽药监察所。实施例1菌影载体PMAL-E-SN的构建(根据图1) 1.引物设计与合成根据Genebank上发表的PhiX174噬菌体裂解基因E (序列号9626372)和金黄 色葡萄球菌核酸酶A (序列号21281729)设计引物El、 E2、 SN1和SN2，分别设 计5个及15个柔性氨基酸Linker的引物(E2' 、 SN1' 、 E2"和SN2")将裂解基因E 与SN基因串连。斜体为Linker部分，所有引物由上海生物工程公司合成。PCR反应所用引物<table>table see original document page 5</column></row><table>E2，' gc flfgaaccflccflccacc afgaaccaccaccacc ag"accaccaccaccctccttccgcac涯，，_ag g膽g敏gg慰g膽g敏敏""g膽膽g敏""gcaacttcaact2.E基因的PCR扩增以PhiX174噬菌体RFI质粒为模板进行PCR扩增94'C预变性3min， 94。C变性 45 s， 54。C退火30 s, 72'C延伸lmin， 30个循环，72。C延伸10 min。结束后取PCR产物5 pL，P/。琼脂糖凝胶电泳鉴定。3.SN基因的PCR扩增提取金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923细菌基因组DNA，根据所设计引物以其 DNA为模板进行PCR扩增94。C预变性3min， 94。C变性45 s本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种菌影载体ＰＭＡＬ－Ｅ－ＳＮ，其特征在于：由Ｅ基因、ＳＮ基因和质粒载体ＰＭＡＬ－ｐ２Ｘ组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：雷连成，杜崇涛，韩文瑜，孙长江，冯新，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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