用于分离包括传统培养基中无法培养的如支原体的物种的临床样本的培养基制造技术

本发明专利技术涉及特异性的用于支原体属微生物的培养基，具体地，用于难以培养的支原体物种(生殖支原体、肺炎支原体、透支原体、发酵支原体、梨支原体和/或猪鼻支原体)。本发明专利技术还提供一种用于属于支原体属的物种生长和/或分离和/或鉴定的体外方法以及使用该培养基的生长支持物。

A culture medium for separating clinical samples of species such as Mycoplasma that can not be cultivated in the traditional culture medium

The invention relates to a specific culture medium for Mycoplasma, especially for Mycoplasma species, such as Mycoplasma, Mycoplasma pneumoniae, mycoplasma, mycoplasma, mycoplasma and / or mycoplasma. The present invention also provides an in vitro method for the growth and / or separation and / or identification of species belonging to the mycoplasma and the use of the growth support of the medium.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于分离包括传统培养基中无法培养的如支原体的物种的临床样本的培养基详述本专利技术涉及用于支原体属微生物的特异性的培养基，并且，具体地，涉及难培养的支原体(生殖支原体、肺炎支原体、透支原体、发酵支原体、梨支原体(Mycoplasmapirium)、猪鼻支原体)。本专利技术还提供了用于属于支原体属物种的生长和/或分离和/或鉴定的体外方法以及使用这种培养基的生长支持物。在先技术的状态支原体是能够自由生活的最小的微生物，它们与病毒不同，可在无细胞的培养基中生长，它们通过二分裂繁殖，因缺乏细胞壁而与细菌不同；然而，它们有三层构成的细胞膜，包括细菌或病毒中均不存在的为结构提供支撑的固醇类物质(1-9)。如果将它们保持在包括其繁殖所需的全部蛋白质络合物的渗透稳定的培养基中，它们没有细胞壁即可存活。可以在动物有机体中或在细胞培养基或具有高度复杂配方的培养基中发现这种情况。支原体属(支原体科、支原体目)的细菌属于柔膜细菌(“光滑的皮肤”)类，它们代表一组复杂而精细的微生物，在原核生物中具有独特性，对于微生物学家来说，目前是一谜团。它们在大自然中普遍存在，目前已知物种的数量正在增加，约为200种，其中许多表现为共生，而其他物种对于人类和动物和植物而言都是致病性的(7-14)。在人类中分离出14个物种，其中12个属于支原体属和2个物种(变型微小脲原体(Ureaplasmabiovarparvum)和解脲脲原体)属于脲原体属。14个物种中的6个主要位于泌尿生殖道(14-21)。支原体具有3个主要的生物学特征，使得它们不同于其它的细菌，并且表征了其与宿主有机体相关的行为特征。这些特征是：1-无细胞壁，且已知在自由生活的微生物中尺寸最小，如其细胞大小(0.2-0.8μm)和其基因(genoma)大小。这种生殖支原体具有包含在能够自动复制的细胞中的最小的基因(580kb，且仅381个基因)，其基因含量决定了用于DNA复制和修复以及遗传转录和翻译所必需的基因的最小数量；2-代谢途径的有限预知。肺炎支原体和生殖支原体的基因组的完整表征证明不存在涉及氨基酸合成的基因并且缺乏用于维生素，核酸、脂肪酸和胆固醇前体生物合成的基因，因此它们完全依赖于他们自己的外源供应，来自宿主生物体的细胞或来自复杂和丰富的培养基，尽管其复杂的组成仅能使得最严苛的支原体物种在2周或更长时间内生长；3-微生物－宿主相互作用，其表现为与上皮细胞和免疫系统的细胞的表面寄生，并且作为一些物种的兼性形式(保持体外细胞外和细胞内活力的能力)的细胞内定位。基因组大小及其碱基组成构成支原体的主要性质。与他们自己的大小相比，支原体物种的基因组为从600到2300kb的范围。例如，肺炎支原体具有816kb的基因组，而生殖支原体的基因组甚至更小，因为其为580kb，并且目前在最先进的研究中，倾向于将其用作研究最小基因组的参考，以具有自主活力为目的。因此可以理解，对于这些药物的复制，强加了复杂的营养需求，因为它们缺乏表征大部分细菌的几种酶学途径，并且它们完全依赖于例如氨基酸、核苷酸、脂肪酸和甾醇类的生物合成前体的外源供应(22-26)。不同的支原体物种的鉴定和实验室的诊断基于基本的细菌学检验，比如：形态学、菌株特征、生化和生理测试。这些测试的实施需要培养菌株，这对某些物种来说是困难的、复杂的和昂贵的。人源性支原体的生长只能通过分离具有确定的致病潜力并且在特异的和标准化的培养基(如脲原体、人支原体和肺炎支原体)中生长相当满意的物种来进行。所有的支原体物种需要复杂的培养基，由甾醇类、脂肪酸、氨基酸和满足营养需求的其他化合物构成。其处理需非常小心，并且需要检查其全部和每个组分。因此，很少有临床实验室提供用作支原体感染的诊断方法的培养基。然而，培养基仍然是临床分离(包括抗性研究)的生物学和分子表征的基础。必须用分子技术(27-30)检测极度刺激性的物种，比如生殖支原体、发酵支原体、透支原体和梨支原体(Mycoplasmapirum)。在开发用于微生物诊断的分子技术后，目前已经开发了分析基因组DNA、核糖体RNA等方法，尽管它们是昂贵的方法，并且其中一些方法只能在具有精密设备、配有高素质人员的实验室中应用。然而，目前有一些分子技术仅对某些支原体物种的诊断足够有效，而其它物种则由于开发复杂性和高成本还在研究中。总而言之，已知的现有培养基主要用作支原体菌株增殖和生长的工具。已知培养基的组成变化能够鉴定特征为生长相对较快的某些支原体物种，例如在包括氨基酸，例如，用于培养人支原体的精氨酸或用于培养微小脲原体和解脲支原体的尿素的培养基的情况下。在肺炎支原体的情况下，可以通过使用包括葡萄糖的市售的培养基进行培养，但是仅在几周后能获得生长。在最苛刻的物种的情况下，例如，生殖支原体，目前是通过市场上可获得的分子技术鉴定。然而，这些方法不能够鉴定具有临床重要性的物种，例如发酵支原体、透支原体、梨支原体。在目前的实践中，为了分离起始于样品的这些菌株，一种方法是将这些菌株接种在细胞培养物中。然而，需要很长时间甚至是大约几个月才能获得菌落。例如生殖支原体、肺炎支原体、透支原体、发酵支原体、梨支原体、猪鼻支原体的特定的支原体物种的培养和鉴定有一系列的缺点，其需要很长的培养时间，不是数周，就是几天(31)。因此，对于某些支原体物种，分子方法仍然是首选。然而，常规培养物对于微生物的微生物学表征是不可避免的。不同的流行病学、遗传和分子研究表明，来自例如生殖支原体和人支原体的药物的感染过程可以有助于某些恶性过程的发展，包括高达20％的前列腺癌和子宫癌。生殖支原体、透支原体和猪鼻支原体是性传播因子，并且据观察，在感染后它们能够将正常上皮细胞转化为恶性细胞。这些物种还与非淋菌性尿道炎有一定的相关性，并且存在于15-20％的患有不同程度的慢性过程和不育症的无症状男性中。开发一种能够分离和鉴定难以培养的支原体物种的培养基的需要仍然是现有技术状态下的公开问题。因此，本专利技术的目的在于提出一种新的和初步的用于解决现有技术状态中存在的并且与分离和鉴定支原体属物种有关的问题的方案。专利技术概述本专利技术来自于开发培养基的需要，该培养基能够有效且快速地同时培养、分离和鉴定属于支原体属的不同物种，特别是难以培养的物种，例如，生殖支原体、肺炎支原体、透支原体、发酵支原体，梨支原体和/或猪鼻支原体。首次描述了一种培养基，大多数支原体属的物种可在该培养基中生长，然后其可将微生物培养技术扩展到广谱的支原体属的物种。具体地，经过长时间的实验和选择工作，本专利技术人检测出能够满足上述需要的培养基配方的主要成分。具体地，包括具有不同来源和组成的主要成分的本专利技术的培养基组成意外地显示出能够使得支原体属物种的充分生长。存在于本专利技术的培养基中的动物血液和组织的水解物尤其重要，其保证了支原体属生长所必需的物质的供应，而不妨碍鉴定。与本专利技术相关的优点之一在于，可以仅基于培养特征(培养基的颜色)进行目标细菌的鉴定，而不需要深入观察菌落的形态学特征，并由不专业的人员容易地解释结果。本专利技术的培养基包括营养物质，所述营养物质足以使得目标微生物快速生长，并阻碍其它并发生物的生长，使得支原体培养的更快，然后可以比利用已知培养基的培养物更短的时间分离和鉴定支原体。具体地，甚至经过1-4天的最本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于支原体属微生物的培养基，其特征在于，包括作为活性成分的：－牛血的水解产物，－来自牛心的提取物；‑牛心的酶解产物；‑乳蛋白的酶解产物；‑大豆蛋白的酶解产物；‑动物组织的酶解产物；‑来自酿酒酵母的自溶产物或水解产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.01 IT 1020150000106011.一种用于支原体属微生物的培养基，其特征在于，包括作为活性成分的：－牛血的水解产物，－来自牛心的提取物；-牛心的酶解产物；-乳蛋白的酶解产物；-大豆蛋白的酶解产物；-动物组织的酶解产物；-来自酿酒酵母的自溶产物或水解产物。2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，还包括革兰氏阴性微生物、革兰氏阳性菌、真菌和酵母的生长抑制剂。3.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，－所述来自牛心的提取物的存在量为约2至56g/L培养基；和/或－所述牛血的水解产物的存在量为约5至30g/L培养基；和/或－所述牛心的酶解产物的存在量为约1至62g/L培养基；和/或－所述乳蛋白的酶解产物的存在量为约1至67g/L培养基；和/或－所述大豆蛋白的酶解产物的存在量为约0.2至34g/L培养基；和/或－所述动物组织的酶解产物的存在量为约2至99g/L培养基；和/或－所述来自酿酒酵母的自溶产物或水解产物的存在量为约15至56g/L培养基。4.如权利要求2或3所述的培养基，其特征在于，所述抑制剂选自下组：萘啶酸、万古霉素、制霉菌素、乙酸铊、酚红，青霉素和两性霉素B。5.如权利要求4所述的培养基，其特征在于，－所述萘啶酸的存在量为0.1至3.5克/升培养基；和/或－所述万古霉素的存在量为0.5至1克/升培养基；和/或－所述制霉菌素的存在量为0.2至5克/升培养基；和或－所述乙酸铊的存在量为0.01至1.5克/升培养基；和/或－所述酚红的存在量为0.03至3克/升培养基；和/或－所述青霉素的存在量为0.1至5克/升培养基；和/或－所...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·特玛戈马丁内斯，
申请(专利权)人：CPM迪克劳迪奥皮尔玛蒂有限公司，
类型：发明
国别省市：意大利,IT