用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法技术

本发明专利技术公开了用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法，包括以下步骤：步骤1，配制液体培养基；步骤2，配制固体培养基；步骤3，采用步骤1制备的液体培养基进行培养获得一代菌种；步骤4，采用步骤2制备的固体培养基进行培养获得二代菌种；步骤5，采用步骤1制备的液体基培养，获得三代菌种；步骤6，荚膜染色、革兰氏染色，将荚膜厚的菌种对应编号的菌液保留；步骤7，四代培养：将荚膜厚的菌液在步骤1制备的液体培养基培养；步骤8，菌种收获、保存。通过本发明专利技术提供的方式筛选出荚膜较厚的菌种，在以前的基础上提高了约80％的荚膜多糖产量，并且多糖经检验符合欧洲药典标准，大大提高了多糖产量，提高了生产效率、降低了成本。

【技术实现步骤摘要】
用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法
本专利技术涉及微生物
，具体涉及用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法。
技术介绍
肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)于1881年首次由巴斯德分离出，是大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎的主要致病源之一，它也能引起中耳炎、鼻窦炎和菌血症等。肺炎链球菌感染是在全球范围内引起死亡的重要原因之一。美国有资料显示，估计每年有40～50万人患肺炎球菌性肺炎，病死率为5％～10％。在用疫苗可预防儿童死亡的疾病中，肺炎链球菌引起的疾病排名第一。随着抗菌素的大量使用，耐药菌株与日俱增，医学界再次关注疫苗的研发。肺炎球菌目前已发现90多种血清型。其细菌表面荚膜具有抗原性，再将肺炎球菌多糖共价连接到载体蛋白使之成为胸腺依赖性(TD)抗原，能够对婴幼儿和老人产生抗体，免疫效果有效提高。现有疫苗均是提取其荚膜多糖为原料制得。自肺炎疫苗研发以来，由于其荚膜多糖产量较低，只有通过尽量扩大生产规模，以达到提高多糖产量的目的，因此生产成本较高。提高多糖产量可从筛选优质菌种、优化发酵工艺、优化纯化工艺等关键工序着手。筛选荚膜较厚的菌种，即是关键工艺之一，从源头上解决这一问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是培养基培养肺炎链球菌获得的荚膜多糖产量较低，目的在于提供用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法，提供了一种组简化的培养基用于菌种的培养，以及适宜的培养方法，通过本专利技术提供的方式筛选出荚膜较厚的菌种，在以前的基础上提高了约80％的荚膜多糖产量，并且多糖经检验符合欧洲药典标准，大大提高了多糖产量，提高了生产效率、降低了成本。本专利技术通过下述技术方案实现：用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法，包括以下步骤：步骤1，配制液体培养基：称取以下原料，采用注射用水对上述原料依次进行溶解，将采用注射用水溶解后的混合溶液进行定容到所需体积，并调节pH值，除菌后获得液体培养基：溶剂为注射用水的相对用量为1000ml：含氮源为：胰酪胨：15～80g，胰胨：20～70g，精选大豆胨：10～80g，大豆胨：10～80g，酸水解酪蛋白：10～70g，酵母提取物：15～40g，酵母浸粉：5～40g中的任意三种组合物；碳源为：葡萄糖：5.0～50g；盐类为：K2HPO4：0～12.0g，KCl：0～7.0g，Na2HCO3：0～5.0g，NaCl：3.0～10.0g，MgSO4·7H2O：0.4～5.0g，CaCl2：0～0.14g；微量元素为：L-半胱氨酸盐酸盐：0.12～1.80g，烟酸：0.5～1.2mg，腺嘌呤：5.5～10.5mg，FeSO4：2.5～6.5mg；步骤2，配制固体培养基：称取琼脂10～15g，加注射用水溶解后定容到所需体积的90％，溶解后的溶液进行湿热灭菌，冷却后备用；称取以下原料，采用注射用水进行溶解，将溶解后的混合溶液进行定容到所需体积，并调节pH值、除菌处理，最后加入琼脂培养基中，倒入平皿，制得固体培养基溶剂；为水的相对用量为1000ml：含氮源为胰酪胨：15～80g，胰胨：20～70g，精选大豆胨：10～80g，大豆胨：10～80g，酸水解酪蛋白：10～70g，酵母提取物：15～40g，酵母浸粉：5～40g中任意三种；碳源为葡萄糖：5.0～50g；盐类为K2HPO4：0～12.0g，KCl：0～7.0g，Na2HCO3：0～5.0g，NaCl：3.0～10.0g，MgSO4·7H2O：0.4～5.0g，CaCl2：0～0.14g；微量元素为L-半胱氨酸盐酸盐：0.12～1.80g，烟酸：0.5～1.2mg，腺嘌呤：5.5～10.5mg，FeSO4：2.5～6.5mg；步骤3，一代培养：启开肺炎链球菌工作种子批菌种，用所述步骤1制备的液体培养基溶解菌块后，接种步骤1制备的液体培养基2～20ml，35℃～37℃、CO2通气量为60％～100％，静置培养4～10h，获得一代菌种；步骤4，二代培养：将一代菌液转接于步骤2制备的固体培养基平皿中，用划线分离法接种，35℃～37℃、CO2通气量为60％～100％，静置培养36～48h，获得二代菌种；步骤5，三代培养：挑取固体培养基上长出的单颗菌落15～20颗，分别接种于步骤1制备的液体培养2～5ml中，编号、培养，培养温度为35℃～37℃、CO2通气量为60％～100％，培养时间为8～17h，培养至菌液明显浑浊时停止培养，获得三代菌种；步骤6，荚膜染色、革兰氏染色：取各编号对应培养后菌液，用墨汁染色法、龙胆紫或沙黄染液染色后镜检，将荚膜厚的菌种对应编号的菌液保留1～5组，其余荚膜薄的菌种对应编号的菌液废弃；重复步骤3、步骤4和步骤5，再次分离筛选，则筛选出的纯菌种；步骤7，四代培养：将荚膜厚的菌液按10％接种量转步骤1制备的液体培养基，进行四代扩增培养，培养温度为35℃～37℃、CO2通气量为60％～100％，培养时间为2～5h，待菌液明显浑浊、OD600≥0.5时收获；步骤8，菌种收获、保存：将菌液离心，收集菌体沉淀保存于10％～30％甘油中，分装，置于液氮中保存。优选地，所述步骤1中，将所述原料均加入同一容器内，然后向盛由原料混合物的容器中在不断搅拌条件下加入注射用水；在添加完注射用水后，进行加热溶解，加热溶解步骤为：先以1℃/min的升温速率由25℃升温至30℃，在30℃温度条件下保持10min，然后以1℃/min的升温速率由38℃升温至35℃，在38℃温度条件下保持5min。优选地，所述步骤1和步骤2中，均采用质量浓度为10％的NaOH溶液调节pH值至7.0～7.8。优选地，所述步骤1中，在无菌操作条件下经0.1μm的过滤减压过滤除菌。优选地，所述步骤2中，向琼脂中加入注射用水并升温至95℃进行溶解；所述步骤2中将琼脂溶液冷却至55～60℃备用。优选地，所述步骤2中，湿热灭菌具体操作为：湿热灭菌温度为117～122℃，压强为0.09～0.12MPa，灭菌时间为15～30min。优选地，所述步骤2中，用注射用水溶解原理的除菌处理为：在无菌操作条件下经0.2μm的过滤减压过滤除菌。优选地，所述菌种采用于肺炎链球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F共24个血清型。本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果本专利技术用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法，本专利技术提供了一种用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法，既能在菌种传代时进行良好的扩增培养，用于发酵培养后，其产糖量也较高；本专利技术提供的利用此液体和固体培养基筛选肺炎链球菌菌种的方法能明显缩短筛选培养的代次，筛选后的菌种活性好、荚膜较厚，菌液浓度和多糖产量都明显提高。具有操作简单、快速、取材容易、降低染菌风险的优点。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术实施例的限定。在附图中：图1为筛选前显微镜油镜图；图2为本专利技术筛选后显微镜油镜图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，配制液体培养基：称取以下原料，采用注射用水对上述原料依次进行溶解，将采用注射用水溶解后的混合溶液进行定容到所需体积，并调节pH值，除菌后获得液体培养基：溶剂为注射用水的相对用量为1000ml：含氮源为：胰酪胨：15～80g，胰胨：20～70g，精选大豆胨：10～80g，大豆胨：10～80g，酸水解酪蛋白：10～70g，酵母提取物：15～40g，酵母浸粉：5～40g中的任意三种组合物；碳源为：葡萄糖：5.0～50g；盐类为：K2HPO4：0～12.0g，KCl：0～7.0g，Na2HCO3：0～5.0g，NaCl：3.0～10.0g，MgSO4·7H2O：0.4～5.0g，CaCl2：0～0.14g；微量元素为：L‑半胱氨酸盐酸盐：0.12～1.80g，烟酸：0.5～1.2mg，腺嘌呤：5.5～10.5mg，FeSO4：2.5～6.5mg；步骤2，配制固体培养基：称取琼脂10～15g，加注射用水溶解后定容到所需体积的90％，溶解后的溶液进行湿热灭菌，冷却后备用；称取以下原料，采用注射用水进行溶解，将溶解后的混合溶液进行定容到所需体积，并调节pH值、除菌处理，最后加入琼脂培养基中，倒入平皿，制得固体培养基溶剂；为水的相对用量为1000ml：含氮源为胰酪胨：15～80g，胰胨：20～70g，精选大豆胨：10～80g，大豆胨：10～80g，酸水解酪蛋白：10～70g，酵母提取物：15～40g，酵母浸粉：5～40g中任意三种；碳源为葡萄糖：5.0～50g；盐类为K2HPO4：0～12.0g，KCl：0～7.0g，Na2HCO3：0～5.0g，NaCl：3.0～10.0g，MgSO4·7H2O：0.4～5.0g，CaCl2：0～0.14g；微量元素为L‑半胱氨酸盐酸盐：0.12～1.80g，烟酸：0.5～1.2mg，腺嘌呤：5.5～10.5mg，FeSO4：2.5～6.5mg；步骤3，一代培养：启开肺炎链球菌工作种子批菌种，用所述步骤1制备的液体培养基溶解菌块后，接种步骤1制备的液体培养基2～20ml，35℃～37℃、CO2通气量为60％～100％，静置培养4～10h，获得一代菌种；步骤4，二代培养：将一代菌液转接于步骤2制备的固体培养基平皿中，用划线分离法接种，35℃～37℃、CO2通气量为60％～100％，静置培养36～48h，获得二代菌种；步骤5，三代培养：挑取固体培养基上长出的单颗菌落15～20颗，分别接种于步骤1制备的液体培养2～5ml中，编号、培养，培养温度为35℃～37℃、CO2通气量为60％～100％，培养时间为8～17h，培养至菌液明显浑浊时停止培养，获得三代菌种；步骤6，荚膜染色、革兰氏染色：取各编号对应培养后菌液，用墨汁染色法、龙胆紫或沙黄染液染色后镜检，将荚膜厚的菌种对应编号的菌液保留1～5组，其余荚膜薄的菌种对应编号的菌液废弃；重复步骤3、步骤4和步骤5，再次分离筛选，则筛选出的纯菌种；步骤7，四代培养：将荚膜厚的菌液按10％接种量转步骤1制备的液体培养基，进行四代扩增培养，培养温度为35℃～37℃、CO2通气量为60％～100％，培养时间为2～5h，待菌液明显浑浊、OD600≥0.5时收获；步骤8，菌种收获、保存：将菌液离心，收集菌体沉淀保存于10％～30％甘油中，分装，置于液氮中保存。...

【技术特征摘要】
1.用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，配制液体培养基：称取以下原料，采用注射用水对上述原料依次进行溶解，将采用注射用水溶解后的混合溶液进行定容到所需体积，并调节pH值，除菌后获得液体培养基：溶剂为注射用水的相对用量为1000ml：含氮源为：胰酪胨：15～80g，胰胨：20～70g，精选大豆胨：10～80g，大豆胨：10～80g，酸水解酪蛋白：10～70g，酵母提取物：15～40g，酵母浸粉：5～40g中的任意三种组合物；碳源为：葡萄糖：5.0～50g；盐类为：K2HPO4：0～12.0g，KCl：0～7.0g，Na2HCO3：0～5.0g，NaCl：3.0～10.0g，MgSO4·7H2O：0.4～5.0g，CaCl2：0～0.14g；微量元素为：L-半胱氨酸盐酸盐：0.12～1.80g，烟酸：0.5～1.2mg，腺嘌呤：5.5～10.5mg，FeSO4：2.5～6.5mg；步骤2，配制固体培养基：称取琼脂10～15g，加注射用水溶解后定容到所需体积的90％，溶解后的溶液进行湿热灭菌，冷却后备用；称取以下原料，采用注射用水进行溶解，将溶解后的混合溶液进行定容到所需体积，并调节pH值、除菌处理，最后加入琼脂培养基中，倒入平皿，制得固体培养基溶剂；为水的相对用量为1000ml：含氮源为胰酪胨：15～80g，胰胨：20～70g，精选大豆胨：10～80g，大豆胨：10～80g，酸水解酪蛋白：10～70g，酵母提取物：15～40g，酵母浸粉：5～40g中任意三种；碳源为葡萄糖：5.0～50g；盐类为K2HPO4：0～12.0g，KCl：0～7.0g，Na2HCO3：0～5.0g，NaCl：3.0～10.0g，MgSO4·7H2O：0.4～5.0g，CaCl2：0～0.14g；微量元素为L-半胱氨酸盐酸盐：0.12～1.80g，烟酸：0.5～1.2mg，腺嘌呤：5.5～10.5mg，FeSO4：2.5～6.5mg；步骤3，一代培养：启开肺炎链球菌工作种子批菌种，用所述步骤1制备的液体培养基溶解菌块后，接种步骤1制备的液体培养基2～20ml，35℃～37℃、CO2通气量为60％～100％，静置培养4～10h，获得一代菌种；步骤4，二代培养：将一代菌液转接于步骤2制备的固体培养基平皿中，用划线分离法接种，35℃～37℃、CO2通气量为60％～100％，静置培养36～48h，获得二代菌种；步骤5，三代培养：挑取固体培养基上长出的单颗菌落15～20颗，分别接种于步骤1制备的液体培养2～5ml中，编号、培养，培养温度...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴强，陈元芬，王宇，马礼耕，
申请(专利权)人：成都欧林生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51