【技术实现步骤摘要】
本申请是1985年1月31日归档的美国专利申请号697036的补充部分。使用热稳定的淀粉酶作为淀粉液化时的稀薄剂是糖类增甜物生产中的一项重要改进。淀粉基质的酶促液化减少了不想要的副产物的形成，并且允许盐的使用在符合需要的低水平，因为在最终的葡萄糖浆中高水平的盐份要用离子交换树脂来除去，会造成额外的生产费用。用酶(如α-淀粉酶)在高温下液化淀粉，主要依靠这种酶的热稳定性，因为受热引起酶的不可逆变性。这种变性造成完全丧失生化催化活性。从嗜热微生物得到热稳定的α-淀粉酶已经用于水解、液化淀粉，或把含淀粉的物质转变成淀粉水解物。例如，美国专利3654081和3912590阐述了地衣形芽孢杆菌产生的热稳定α-淀粉酶在高温下对淀粉的液化作用。许多商业上得到的α-淀粉酶产品来源于细菌，如枯草杆菌、地衣形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等。真菌的α-淀粉酶在高温下液化淀粉的应用十分有限，因为一般认为它们不是热稳定的酶。淀粉的酶解液化通常在高温下进行，以提高淀粉对酶促水解的敏感性。在液化过程优先采用的高温条件下，即使用热稳定的α-淀粉酶，也会造成上述的生物催化活性的丧失。于是，把稳定剂加到酶里提高酶的热稳定性。Wallerstein已在美国专利905029中公开，通过把硫酸钙加到含淀粉的培养基中来增强淀粉的酶促高温糖化作用。用钙离子使α-淀粉酶对热稳定，已经在工艺上普遍接受，但仍有某些缺点，如上述加盐到淀粉中出现的问题等即是。近来，美国专利3654081中已公开，通过把钙盐和/或钠盐加入到最好有一些α-淀粉酶的淀粉水浆中，淀粉就能很容易被完全液化。美国专利391259...
【技术保护点】
增强细菌α－淀粉酶的热稳定性的方法，其特征是在α－淀粉酶水溶液中加入稳定量的亲水脂两性物。
【技术特征摘要】
US 1985-1-31 697036;US 1985-8-22 768370。Pace等在J.Biol.Chem.中报导溶菌酶在各种不用浓度的三乙基葡萄糖胺(tri-N-acetyl-gluco samine)时的热变性及盐酸胍变性。三乙基葡萄糖胺专一地结合在自然状态溶菌酶的活性部位，并且它的存在会导致蛋白质对热和盐酸胍变性的很容易观察得到的稳定作用。把氯离子加到α-淀粉酶的水溶液中，已发现它会提供某些热稳定作用，尽管加氯离子的最初目的是调节PH值。在美国专利4，497，867中，公开了延长枯草杆菌素(Subt-ilisin Carlsberg)的蛋白酶贮存期限(Shelf-life)的方法，它包括在酶溶液里加入钙离子和从甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐及混合物中选出来的一种水溶性羧化物。美国专利4，318，818公开了一种稳定的酶水溶液的组分，它包括a)0-75%左右一种减低表面张力的清洁剂b)0.025%-10%左右的纯酶，最好是一种蛋白水解酶;c)0-60%的低分子量的一级醇或二级醇;d)0.1-10%左右的短链羧酸盐，最好是甲酸盐;e)足够量的可溶性钙盐，每升提供0.1到10毫克分子的钙离子;和f)其余为水补足。在典型的工业操作中，淀粉是用热稳定的α-淀粉酶在80°-110℃左右的温度范围内，pH6.0以上被液化。为了在高温时酶进一步稳定化，一般加入钙盐(50-150ppmCa++)。这些条件下进行淀粉酶促液化有三个缺点。首先，淀粉在pH6.0以上、80℃或更高温度进行水解，会促使淀粉还原基团的同分异构化，结果在以后的转化过程中形成maltulose，造成最后葡萄糖产量的下降。第二，液化了的淀粉进一步糖化产生葡萄糖，再转化成果糖，其中所使用的葡萄糖淀粉酶的最佳pH，对于麹霉菌型的葡萄糖淀粉酶来说，一般在4.5左右，而对于根霉菌型的酶来说是5.0左右。这样，当淀粉在pH6.0或6.0以上液化时，必须在用葡萄糖淀粉酶进行糖化之前就降低pH，这种调正pH，因加了酸而增加了葡萄糖浆中的盐含量，进而提高了为除去过多的盐所需要的离子交换树脂的费用。因为液化作用在pH6.0或6.0以下进行，必须补加钙离子(达到约500ppm)。这样，就使得从淀粉糖化制备的葡萄糖浆中完全除去钙离子一事变复杂了。(此葡萄糖浆系为用葡萄糖异构酶法生产高果糖玉米浆而制备的)为增强α-淀粉酶在水溶液中的热稳定性，提出一种新的方法是十分需要的，这是本发明的目的。进一步的目的是要用这种方法制定出一种稳定化的α-淀粉酶的组成。附带的目的是要提供这样一种组成，它不需要加入钙离子，而能在很低水平的钙(25-50ppm)的情况下液化淀粉。另一目的是要提供pH低到5.0时能用于高温液化淀粉的一种反应组成。本发明是一种增强细菌α-淀粉酶对热稳定性的方法。这方法包括在α-淀粉酶水溶液中加入致稳量的一种亲水脂两性物(amph-iphile)。用这一方法稳定化的α-淀粉酶溶液及其在淀粉液化中的应用也是本发明的范围。本发明使用的α-淀粉酶是通过在营养生长培养基上培养适当的微生物所形成的胞外酶来产生的。亲水脂两性物稳定剂可以在除去微生物或酶溶液浓缩之前或之后加入。然后，在典型的操作中，微生物细胞用常规方法(如带有倾倒装置的离心或过泸)从含有α-淀粉酶的培养液中除去。再用超过泸和真空蒸发技术浓缩过泸物，以提供具有所需活性水平的酶溶液。这种酶溶液最好还要用本发明的方法使之稳定化。提高α-淀粉酶溶液的热稳定性还通过加入致稳定量的亲水脂两性物来实现。至于亲水脂两性物(amphiphile)这一术语，我们的意思是一种分子或离子，具有极性的(水溶的)头部和非极性的(水不溶的)尾端。此外，亲水脂两性物必须大得足以每端表现出它自己的溶解性行为。亲水脂两性物的一般结构式是 其中X表示一个极性的或离子基团，如COO-，NH+4，OH，SO＝4，SO＝3或CONH2，而R是非极性部分。这样，不同种类的亲水脂两性物被考虑到有助于α-淀粉酶的热稳定性作用。有用的亲水脂两性物的例子有醇类(如乙醇、丙醇、丁醇、苯甲醇等)，胺(如苯胺、丁胺、乙胺、己胺等)，酰胺(如丁酰胺、乙酰胺、苯乙酰胺、苯甲酰胺等)。我们不打算在解释该发明如何起作用时拘泥于任何专门理论，而是相信亲水脂两性物由于彼此间静电的和疏水性的相互作用有助于α-淀粉酶的热稳定性。在优先考虑的实例中，亲水脂两性物的离子基团是具有化学式R-COO-表示离子部分的羧酸盐，其中R是H，或者含有2到14个碳原子的脂肪族或芳香族基团。更特殊地，R能够是甲基、乙基、正丙基或异丙基、正丁基或异丁基、苯基或者被取代的苯基等。含有羧酸盐的亲水脂两性物能够以相应的羧酸形式引入到α-淀粉酶水溶液里，由于酸的盐有较高的溶解性，因此更倾向一种羧酸的钠盐或钙盐。羧酸盐的离子，典型的代表是它们的钠盐形式，以一种致稳量加入到α-淀粉酶水溶液里(致稳量就是在很大程度上会提高酶对热失活的抗性所需要的量)。商业上得到的α-淀粉酶制备物经分析已显示出，它们在以实例Ⅰ所述测定MWU表示的每百万单位酶活力中，含有0.02克乙酸盐离子。存在乙酸盐离子可能是加乙酸调pH的结果。这样低的浓度并不足以给α-淀粉酶提供有意义的热稳定性。通常乙酸盐的浓度应该每克分子α-淀粉酶大约是2.89×103克分子，这里为计算起见，α-淀粉酶的分子量为58.000。这相当于每百万单位酶活力有0.24克乙酸盐。其它亲水脂两性物使酶能有效地稳定所需的最低水平，随所用各种物质而有改变，但这种水平不需过多地实验就很容易测定。乙酸盐作稳定剂时，稳定化的α-淀粉酶系统配方的制备通常加乙酸离子的钠盐到α-淀粉酶水溶液的浓缩物中，最终浓度是具有170，000-180，000 MWU/ml活性的酶浓缩物100ml中加入10克乙酸钠。在另一个实例中，加入α-淀粉酶之前或之后，把亲水脂两性物加到淀粉中，其加入量应足以使亲水脂两性物对α-淀粉酶形成当量比例。实施本发明的方法在下列实例中作进一步的阐述。实例Ⅰα-淀粉酶样品是用地衣形芽孢杆菌的一突变株培养在适当的营养生长培养液中产生的。发酵后，微生物细胞用常规方法除去，在溶液里剩下胞外酶。含酶的溶液再用超泸方法和真空蒸发浓缩到所要的活性水平340，000-360，000 MWU/克(每克中含修改过的Wohlgemuth单位)。α-淀粉酶的活性是用淀粉-碘复合物的蓝值下降测定可溶性淀粉的水解来量度的。在一个典型操作中，5ml缓冲在pH5.4的2%可溶性淀粉和4ml水，同1ml适当稀释的酶在40℃水浴里一起保温。在每一定时间间隔(从加酶开始5-30分钟)取出1ml，注入到有5ml稀碘液的试管内，摇匀，显示的颜色再在Hellige公司600DA型日光比较亮度计(daylight comparator illuminator)来监测达到反应终点，以修改的Wohlgemuth单位监测酶的活力。一个修改的Wolhgemuth单位(MWU)是使1ml可溶性淀粉在测定的条件下，30分钟内糊精化为一定的蓝值的酶活力。用公式计算如下MWU/g＝ (100×30)/(TW)这里，100＝每个保温混合物中淀粉的毫克数，30＝以分钟表示的一定的糊精化时间，T＝以分钟表示达到反应终点所需时间，W＝加到保温混合物中的酶重量，以酶稀释液1ml样品里酶量的克数。乙酸钠以各种不同的量加入到适当稀释过的(340，000 MWU/ml-1700 MWU/ml或0.2mg/ml蛋白质)酶溶液里，而保持溶液pH为5.8。每个溶液的酶活力以上述方法测定。然后酶溶液加热到90℃、10分钟。加热后再测酶活力。以确定加入乙酸钠对酶稳定性有什么影响(如果有影响的话)。乙酸钠不同水平的实验结果示于表1表1.乙酸盐浓度对α-淀粉酶热稳定性的影响每百万单位酶活力 酶活力(MWU/ml)加乙酸钠的克数 室温下 加热后 残余活力百分数对照 0 1714 0 00.235 1578 231 12.70.47 1714 286 15.72.35 1714 837 46.04.70 1818 735 40.411.75 1818 522 28.7从表1可以确定，以乙酸钠的形式加入乙酸盐离子会增强α-淀粉酶的热稳定性。并且，所观察到的稳定作用随着乙酸盐浓度的增加而增加，在每百万单位酶活力有2.35克乙酸钠时达到最大活性，超过这个浓度水平时，热稳定性开始下降。实例Ⅱ单羧酸的钠盐，如甲酸钠，乙酸钠，丙酸钠和丁酸钠加入到含有40mg/ml蛋白质的酶溶液(α-淀粉酶活力为340，000MWU/ml)中，最终浓度为1.22M。适当稀释后(1×100)，酶溶液在pH5.8加热到95℃，通过稀释的酶液在不同时间间隔加热后测定残留的活性，来计算酶的热稳定性。50%失活所需时间(即半衰期，t 1/2 )从残余活性百分数的对数，对保温时间作图进行计算。这些计算结果示于图1。从图1可以看到...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒙哥马利，柯蒂斯，杰里，谢泰，杰亚拉马，卡登戈，辛格利埃里克查尔斯，
申请(专利权)人：詹伦卡国际印第安那州有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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