具有葡糖淀粉酶活性的多肽及其制备方法技术

本发明专利技术涉及具有葡糖淀粉酶活性且具有改善的特性的多肽，和涉及包含适用于生产食品、饮料(例如啤酒)、饲料或者生物燃料的这些多肽的组合物。还描述了适用于大规模蛋白质纯化程序的用于分离葡糖淀粉酶的改进和成本效益好的方法。此外，公开了例如在酿造工艺中与根据本发明专利技术的葡糖淀粉酶有关的不同方法和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】[000? ] 序列表的引用所附的是包括SEQ ID NO:1_17的序列表，其全文以引用的方式并入本文。
本专利技术涉及具有葡糖淀粉酶活性且具有改善的特性的多肽，和涉及包含适用于生产食品、饮料(例如啤酒)、饲料或者生物燃料的这些多肽的组合物。还描述了适用于大规模蛋白质纯化程序的用于分离葡糖淀粉酶的改进的和成本效益好的方法。此外，公开了例如在酿造工艺中与根据本专利技术的葡糖淀粉酶有关的不同方法和用途。
技术介绍
葡糖淀粉酶(葡聚糖1，4_α -葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是淀粉水解外切作用糖酶，其催化从淀粉或相关的寡糖和多糖分子的非还原末端移除连续的葡萄糖单位。葡糖淀粉酶可水解淀粉(如直链淀粉和支链淀粉)的直链的和分支的糖苷键。葡糖淀粉酶由多种细菌、真菌和植物的株系产生。某些真菌葡糖淀粉酶例如从曲霉菌属(Aspergillus)的菌株产生和分泌。其他真菌(例如红曲霉(Monascus))在发酵食品的制备中具有悠久的传统。例如，红曲霉菌株在中国和日本已 用于制造豆腐。历史上，真菌主要用作食品添加剂。通常使该生物体在稻米上生长，干燥并研磨，并且作为“红米”(RotReis)添加到肉制品。多种食物成分也由红曲霉物种产生。例如，在家庭和工业中使用的色素由紫红曲霉(Monascuspurpureus)产生。红曲霉还用作替代药物。例如，红曲米是受紫红曲霉感染的稻米，它是被认识到能降低血液胆固醇的天然食品。活性组分HMG-CoA还原酶抑制剂可降低总的血液胆固醇以及血液LDL胆固醇水平，甚至可逆转冠状动脉疾病。由紫红曲霉制得的产品被称为莫那可林K (Monacolin K)或红曲胶囊(Cholestin)(华茂公司(Pharmanex))。也已提出将红曲霉发酵提取物充当抗癌药物，如美国专利申请公布N0.2004/0081663 Al中所公开的。如美国专利N0.6，613，365所公开的，描述了高粱红曲霉(Monascus kaoliang)在动物饲料中的用途。JP2007097462描述了培养紫红曲霉以产生液体曲(用于制作发酵食品/饮料)，其具有可检测的葡糖淀粉酶活性。美国专利N0.4.870，014描述了来自糖化酵母(S.diastaticus)的不耐热葡糖淀粉酶的克隆，以及其在酿酒酵母(S.cerevisiae)中的表达以供在酿造的发酵步骤期间使用。美国专利N0.4.318，989描述了从树脂枝孢霉(Cladosporiumresinae)产生葡糖淀粉酶(葡糖淀粉酶和外切支链淀粉酶)以供在酿造的发酵步骤期间使用的方法。公认的是，葡糖淀粉酶是十分重要的商品酶并且已用于需要对淀粉进行水解(例如，用于从淀粉产生葡萄糖和其他单糖)的广泛的各种应用中。然而，大部分商品葡糖淀粉酶由黑曲霉(Aspergillusniger)的真菌菌株产生。来自这些真菌源的分泌的蛋白产物的很大一部分为α -淀粉酶，当目标是分离葡糖淀粉酶时其为不期望的产物。这些不需要的酶和其他背景蛋白质产物的存在减慢了分离所需葡糖淀粉酶的过程，并且不可避免地减小每批次的总产率。因此，仍然需要制备和分离高品质产率的葡糖淀粉酶，同时减少制备过程中的不需要的产物。已公开了来自高粱红曲霉的两种形式的葡糖淀粉酶的纯化和特性(Iizuka etal.，(1977)，J.Gen.Appl.Microbiol.,23(5):217-230 (Iizuka 等人，1977 年，《普通与应用微生物学杂志》，第 23 卷，第 5 期，第 217-230 页)；Iizukaet al.，(1978)，J.Gen.Appl.Microbiol.,24:185-192 (Iizuka等人，1978年，《普通与应用微生物学杂志》，第24卷，第185-192页))。两种葡糖淀粉酶据称在最高至50°C下是稳定的，但是在约60°C _70°C的温度下葡糖淀粉酶活性急剧下降。两种形式的葡糖淀粉酶的序列在此文章中或在随后的出版物中均未公开。 在淀粉衍生的碳水化合物的水解中使用葡糖淀粉酶在酿造工业中越来越重要，特别是用于生产高发酵度(有时称为低卡路里)啤酒。出于与产品稳定性和法规有关的原因，重要的是在最终啤酒中所添加的酶活性被除去/灭活。遗憾的是，当葡糖淀粉酶源自通常来源曲霉属菌种(Aspergillus spp.),例如黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori)；腐质霉属菌种(Humicola spp.);篮状菌属菌种(Talaromyces spp.),例如埃默森篮状菌(T.emersonii);阿太菌属菌种(Athelia spp.),例如罗氏阿太菌(A.rolfsii);青霉属菌种(Penicillium spp.),例如产黄青霉(P.chrysogenum),并且所述酶在酿造过程中被添加到发酵容器(FV)中时，由于所述酶的热稳定性，该要求难以满足。虽然将葡糖淀粉酶添加到糖化醪制备容器中，或在麦芽汁煮沸前的任何阶段添加，可以避免该问题，但是这引入了其他实际困难。美国专利N0.4，666，718描述了采用包括酿造酶葡糖淀粉酶的反应器的酿造工艺，该酿造酶葡糖淀粉酶固定在固体载体上，由此可从产物回收酶。美国专利N0.5，422，267A描述了采用表达重组葡糖淀粉酶的基因工程酵母的酿造工艺，但是其中该酶由酵母分泌。因此，仍然需要例如具有葡糖淀粉酶活性的组合物形式的多肽，其可添加到使用常规设备来制备发酵饮料(例如啤酒)的常规工艺中的任何阶段，并且其活性可从最终产物安全地除去。将例如组合物形式的具有葡糖淀粉酶活性的多肽添加到在制备发酵饮料中使用的发酵容器(FV)中是特别有效的。益处为例如酶剂量降低、淀粉向可发酵碳水化合物的转化增加(例如因为异麦芽糖产生量低)，以及酵母应激降低。这种方法并不常用的原因是，活性酶于是可存在于最终产物中，如上所述这是不期望的。市售葡糖淀粉酶一般是热稳定的，并且在发酵饮料的巴氏灭菌过程中施加的能量不足以使酶失活。因此，还需要不耐热的葡糖淀粉酶，其可在发酵之后通过巴氏灭菌来灭活。
技术实现思路
本专利技术涉及具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，其选自:a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽的氨基酸序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性；b)由以下编码的多肽:i)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4中包含的核酸序列、或ii) i)的cDNA序列、或iii) SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的序列、或iv)在至少低严格性条件下与i)、?)、或iii)的互补链杂交的多核苷酸；c)包含氨基酸序列中的一种或多种氨基酸的保守取代、缺失和/或插入的多肽，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽；d)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列与SEQ ID NO:3或6的成熟多肽编码序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 同一性；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽选自：a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：3和6的成熟多肽的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；b)由以下编码的多肽：i)在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4中包含的核酸序列、或ii)i)的cDNA序列、或iii)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的序列、或iv)在至少低严格性条件下与i)、ii)、或iii)的互补链杂交的多核苷酸；c)包含氨基酸序列中的一种或多种氨基酸的保守取代、缺失和/或插入的多肽，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：3和6的成熟多肽；d)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：3或6的成熟多肽编码序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；和e)a)、b)、c)或d)的多肽的具有葡糖淀粉酶活性的片段。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.01.16 EP 12151285.9;2011.12.22 US 61/5794291.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽选自: a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与选自SEQID NO:3和6的成熟多肽的氨基酸序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、90%、95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性； b)由以下编码的多肽:i)在SEQID NO:1或SEQ ID NO:4中包含的核酸序列、或ii) i)的cDNA序列、或iii)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的序列、或iv)在至少低严格性条件下与i)、?)、或iii)的互补链杂交的多核苷酸； c)包含氨基酸序列中的一种或多种氨基酸的保守取代、缺失和/或插入的多肽，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽； d)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列与SEQID NO:3或6的成熟多肽编码序列具有至少 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 同一性；和 e)a)、b)、c)或d)的多肽的具有葡糖淀粉酶活性的片段。2.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与选自SEQID NO:3和6的成熟多肽的氨基酸序列具有至少75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性。3.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽由以下编码:i)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4中包含的核酸序列、或ii) i)的cDNA序列、或iii) SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的序列、或iv)在至少低严格性条件下与i)、?)、或iii)的互补链杂交的多核苷酸。4.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽包含选自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。5.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽由包含与SEQ ID NO:3或6的成熟多肽编码序列具有至少 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。6.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽为根据权利要求1-5中任一项所述的多肽的片段。7.根据权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸序列包含选自以下组的至少一种或多种氨基酸残基: a)选自与SEQID NO:3或6中的第459位对应的位置处的A和P的氨基酸残基， b)选自与SEQID NO:3或6中的第473位对应的位置处的C和S的氨基酸残基， c)选自与SEQID NO:3或6中的第474位对应的位置处的A和R的氨基酸残基， d)选自与SEQID NO:3或6中的第475位对应的位置处的A和P的氨基酸残基， e)选自与SEQID NO:3或6中的第476位对应的位置处的T和Y的氨基酸残基， f)选自与SEQID NO:3或6中的第477位对应的位置处的P和G的氨基酸残基， g)选自与SEQID NO:3或6中的第479位对应的位置处的A和G的氨基酸残基和/或 h)选自与SEQID NO:3或6中的第480位对应的位置处的V和R的氨基酸残基。8.根据权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQID NO:3或6的氨基酸序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性。9.根据权利要求1-8中任一项所述的多肽，所述多肽包含SEQID NO:3或6的氨基酸序列或其具有葡糖淀粉酶活性的片段，或者由SEQ ID NO:3或6的氨基酸序列或其具有葡糖淀粉酶活性的片段组成。10.根据权利要求1-9中任一项所述的多肽，所述多肽包含SEQID NO:3或6的成熟多肽，或者由SEQ ID NO:3或6的成熟多肽组成。11.根据权利要求1-10中任一项所述的多肽，其中一种氨基酸序列与另一种氨基酸序列的同一性百分数通过使用具有如下默认设置的蛋白质-蛋白质Blast搜索(http://blast, ncb1.nlm.nih.gov)来测定:得分矩阵:blosum62,非冗余蛋白质序列数据库和blast算法 12.根据权利要求1-11中任一项所述的多肽，所述多肽通过巴氏灭菌例如在啤酒中使用小于50、45、40、35、30、25、24、23、22、21或20个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。13.根据权利要求1-12中任一项所述的多肽，所述多肽的葡糖淀粉酶活性(GAU)为0.05-10GAU/mg,例如 0.l_5GAU/mg，例如 0.5_4GAU/mg，例如 0.7_3GAU/mg，或例如 1-3GAU/mg ο14.根据权利要求1-13中任一项所述的多肽，其中所述多肽不具有SBD。15.根据权利要求1-14中任一项所述的多肽，所述多肽具有至多480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、495、500、505、507、515、525、535、545、555、565 或 573 个氨基酸残基。16.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其中所述多肽与SEQID NO:3相比是截短的。17.根据权利要求1-16中任一项所述的多肽，所述多肽通过在宿主细胞中的重组表达来获得。18.一种核酸，所述核酸能够编码根据权利要求1-17中任一项所述的多肽。19.一种表达载体,所述表达载体包含根据权利要求18所述的核酸,或者能够表达根据权利要求1-17中任一项所述的多肽。20.如权利要求19所定义的表达载体或质粒，所述表达载体或质粒包含源自木霉属(Trichoderma)的启动子,例如源自里氏木霉(T.reesei) cbhl的启动子。。21.如权利要求19所定义的表达载体或质粒，所述表达载体或质粒包含源自木霉属的终止子，例如源自里氏木霉cbhl的终止子。22.根据权利要求19所述的表达载体或质粒，所述表达载体或质粒包含一种或多种选择性标记，例如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS和pyrG。23.根据权利要求19所述的表达载体或质粒,所述表达载体或质粒包含允许在宿主细胞中维持非染色体质粒的一个或多个端粒区域。24.一种宿主细胞，所述宿主细胞具有如权利要求1-17中任一项所定义的多肽的异源表达。25.如权利要求17和24中任一项所定义的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真菌细胞。26.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述真菌细胞属于木霉属。27.根据权利要求26所述的宿主细胞，其中所述真菌细胞属于里氏木霉物种。28.根据权利要求26所述的宿主细胞，其中所述真菌细胞属于红褐肉座菌(Hypocreajecorina)物种。29.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求19-23中任一项所定义的质粒或表达载体，优选地使用所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：JF克拉梅，NM菲什，PE德格恩，I尼科拉伊，P克鲁伊托夫，P范索林根，S范斯蒂格特坦恩斯，S布雷内曼，JK舍蒂，SH李，
申请(专利权)人：杜邦营养生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK