制备固定化酶共轭体的方法及由此制备的固定化酶共轭体技术

一种制备固定化酶共轭体的方法，其中用多官能胺活性物质处理酶，以在固定于固体支持物前形成处理过的含酶加合物，所述固体支持物已与多胺化合物溶液接触过。对于使用葡糖淀粉酶、真菌α－淀粉酶和β－淀粉酶，该方法是特别优选的。用该方法形成的固定化酶共轭体包括处理过的含酶加合物。本文公开的固定化酶共轭体比其它方法得到并提供的更稳定，而且固定于其中的酶被束缚得更紧。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及制备固定化酶共轭体的方法及用该方法制备的稳定的固定化酶共轭体。酶一般是水溶性的，因此，若未将其固定在支持物上(游离的酶)就用于反应介质，则很难将其从中回收以便再使用。由于必须经常更换，因此造成与使用所述酶有关的成本的提高。此外，尽管可在间歇法中有效地使用游离(未固定的)酶，但不适用于连续的工业化方法。为了降低酶更换造成的高成本，已设计了各种使用前固定酶的方法。所述固定使得可以很方便地从反应介质中回收酶，以便连续地再使用。根据生物催化反应底物的性质，可以在各种反应器系统，如填充柱和搅拌式反应罐中使用这些固定化酶。用于固定酶的方法包括使用由无机或有机物质制成的固体支持物形式的载体。所述物质包括如，γ-矾土，二氧化钛，活性碳颗粒，硅藻土颗粒，玻璃珠，多孔玻璃，浮石，硅胶，金属氧化物和氧化铝。可以用化合物或化合物的混合物将酶粘附到所述载体上，特别值得一提的是聚乙烯亚胺和戊二醛。但是，所述方法的缺点是不能将酶紧紧缚于载体上(或与其键合或载留在其中)。因此，酶可以与载体分开(不结合)，在反应介质中成为“游离的”。实际上，酶和载体间存在的使其结合在一起的力常常很弱，以致被加工的底物存在时，很容易从载体中放出酶，从而丢失在反应介质中。美国专利No.4，713，333公开了一种方法，其中将酶固定在硅藻土颗粒上。该方法涉及将多孔硅藻土颗粒与聚乙烯亚胺溶液接触。然后，将含聚乙烯亚胺的硅藻土与戊二醛接触。最后，向其中加入酶水溶液，由此将酶固定于其上。尽管它是特别有用的，然而从其稳定性及半衰期看，仍可改善用这种方法形成的固定化酶共轭物。因此，可以看出，仍有必要提供酶共轭体形式的将酶固定的方法，以便将酶紧缚(或保持)在由此形成的共轭体内，从而使固定化酶不能从共轭体的剩余部分“脱离出来”并丢失于反应介质中。进一步看出，仍有必要提供使酶紧缚于其上和/或其中的(稳定的)固定化酶共轭体，以便在所述共轭体的使用期间，减少酶从反应介质中丢失，从而实现其生产率的明显改善。本专利技术的主要目的是提供一种制备固定化酶共轭体的方法，其中将酶紧缚于(稳定的)由此制备的固定化酶共轭体内和/或其上。本专利技术的另一主要目的是提供一种制备固定化酶共轭体的方法，以便使由此获得的固定化酶共轭体不失活，并且使由此制备的固定化酶共轭体比用其它方法得到的同类产品具有改善的半衰期。本专利技术的另一主要目的是提供固定化酶共轭体，它具有比用其它方法得到的同类产品改善的半衰期，以实现其生产率的显著改善。本专利技术的另一主要目的是提供稳定的固定化酶共轭体，即使共轭体的酶紧缚于共轭体之内(或其上)，以减少酶丢失于反应介质中。按本专利技术的指导，公开了制备固定化酶共轭体的方法。该方法包括将固体支持物，如多孔硅藻土颗粒与含有至少一个侧链胺基的聚胺化合物溶液接触。用这种方法，可以得到载体。将酶与至少一种胺活性物质溶液接触，从而使酶得到处理。所述胺活性物质选自多官能醛，多官能有机卤化物，多官能酐，多官能偶氮化合物，多官能异硫氰酸盐(酯)，多官能异氰酸盐(酯)和两种或多种这些胺活性物质的混合物。用这种方法，形成处理过的含酶和处理过的加合物相互接触，以使载体与处理过的加合物形成稳定、有活性的固定化酶共轭体(下文有时各称为“固定化共轭体”，“酶共轭体”，“处理过的含酶共轭体”，“处理过的共轭体”和“共轭体”)。在这方面，载体和处理过的加合物反应是优选的，以使处理过的加合物的胺活性物质与多胺载体化合物结合。优选的是在与处理过的加合物接触前，洗涤载体，以从中除去过量的多胺化合物。优选的，多胺化合物选自聚乙二胺，聚乙烯亚胺(如聚二亚乙基三胺，聚三亚乙基四胺，聚五亚乙基六胺或聚六亚甲基二胺);聚亚甲基环已胺;聚亚甲基二苯胺;聚四亚乙基五胺，聚亚苯基二胺及两种或多种这些多胺化合物的混合物。更优选的多胺化合物选自分子量为500-100，000道尔顿且水溶性的上述化合物。最优选的多胺化合物是聚乙烯亚胺。优选的，胺活性物质选自多官能醛，多官能有机卤化物，多官能酐，多官能偶氮化合物，多官能异硫氰酸盐(酯)，多官能异氰酸盐(酯)及两种或多种这些胺活性物质的混合物。更优选的胺活性物质选自戊二醛，琥珀醛，对苯二醛，二重氮基联苯胺-2，2′-二磺酸，4′，4-二氟-3，3′-二硝基二苯基砜，二苯基-4，4′-二硫氰酸酯-2，2′-二磺酸，3-甲氧基-二苯基甲烷-4，4′-二异氰酸酯，甲苯-2-异氰酸酯-4-异硫氰酸酯，甲苯-2，4-二异硫氰酸酯，重氮基联苯胺，重氮基联苯胺-3，3′-联茴香胺，N，N′-六亚甲基二碘乙酰胺，1，6-已二异氰酸酯，氰尿酰氯，1，5-二氟-2，4-二硝基苯及两种或多种这些胺活性物质的混合物。最优选的胺活性物质选自多官能醛。特别优选的胺活性物质选自戊二醛，琥珀醛，对苯二醛。用戊二醛已得到最好的结果。优选的处理过的含酶加合物与洗涤过的载体间的比率为每克载体约0.05ml到0.6ml处理过的加合物。优选的胺活性物质与酶之间的比率为ml酶约0.10g到约1.50g胺活性物质。在优选的实施方案中，在包括搅拌的条件下，将酶与胺活性物质溶液接触。在另一优选的实施方案中，固定化酶共轭体形成后用水洗涤。本文公开的方法适用于制备任何酶的固定化酶共轭体，所述酶含有能与胺活性物质反应的氨基。也可以固定两种或多种酶。这些酶包括胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，已糖激酶，无花果蛋白酶，菠萝蛋白酶，乳酸脱氢酶，乳糖酸，葡萄糖异构酶，葡糖淀粉酶，胰凝乳蛋白酶，链霉蛋白酶，酰基转移酶，蔗糖酶，淀粉酶，支链淀粉酶，转葡糖苷酶，葡萄糖氧化酶，胃蛋白酶，蛋白酶，过氧化氢酶，羟化酶，凝乳酶，转移酶及其混合物。这些酶优选地包括葡萄糖异构酶，葡糖淀粉酶，蔗糖酶，β-淀粉酶，细菌α-淀粉酶，真菌α-淀粉酶，转葡糖苷酶及其混合物。更优选地这些酶包括葡糖淀粉酶，细菌α-淀粉酶，β-淀粉酶及其混合物。用由SOLVAY ENZYMES，Inc.(Elkhart，Indiana)以DIAZYME L-200商标销售的葡糖淀粉酶已经得到了满意的结果。用由SOLVAY ENZYMES，Inc.(Elkhart，Indiana)以CLARASE L-40，000商标销售的真菌α-淀粉酶已得到了满意的结果。最后，用以SPEZYME BBA 1500商标销售的β-淀粉酶也得到了满意的结果。根据本专利技术的指导，公开了制备固定化葡糖淀粉酶共轭体的方法。该方法包括将固体支持物与聚乙烯亚胺溶液接触。用该方法，得到载体。将葡糖淀粉酶与戊二醛溶液接触，由此处理葡糖淀粉酶。用该方法形成处理过的含葡糖淀粉酶的加合物。最后，将载体和处理过的含葡糖淀粉酶的加合物相互接触，使载体和处理过的含葡糖淀粉酶的加合物反应，形成稳定、有活性的固定化葡糖淀粉酶共轭物。优选的，固体支持物是多孔的。更优选的，固体支持物是多孔硅藻土颗粒。根据本专利技术的指导，公开了制备固定化真菌α-淀粉酶共轭体的方法。该方法包括将固体支持物与聚乙烯亚胺溶液接触。用该方法得到了载体。将真菌α-淀粉酶与戊二醛溶液接触，由此处理了α-淀粉酶。用该方法形成了处理过的含α-淀粉酶的加合物。最后，将载体和处理过的含α-淀粉酶加合物彼此接触，使载体和处理过的含α-淀粉酶加合物反应，形成稳定、有活性的固定化真菌α-淀粉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备固定化酶共轭体的方法，包括下列步骤：（ａ）将多孔硅藻土颗粒与含有至少一个侧链胺基的多胺化合物溶液接触，形成载体；（ｂ）将酶与至少一种胺活性物质溶液接触，所述胺活性物质选自：多官能醛、多官能有机卤化物、多官能酐、多官能偶氮化合 物、多官异硫氰酸盐（酯）、多官能异氰酸盐（酯）及两种或多种这些胺活性物质的混合物，由此形成处理过的含酶加合物；和（ｃ）将载体和处理过的加合物接触，以使载体和处理过的加合物反应形成固定化酶共轭体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：OJ兰特罗，JW布鲁瓦，SM沙巴，
申请(专利权)人：詹伦卡国际印第安那州有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]