从全发酵啤酒回收细胞外酶的方法技术

采用把聚合物与无机盐的混合物加入啤酒的方法，可以从全发酵啤酒回收细胞外酶．该总混合物产生一种富酶聚合物相和含有细胞碎片，贫酶盐相，可以分离两相．从聚合物相产生富酶产品．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是1985年9月4日提出的美国专利申请号775，031的继续部分。众所周知，工业用酶的生产是采用在含水营养培养基中培养微生物的方法，例如培养细菌、真菌和酵母。根据特定微生物的性质，生产的酶(类)可能是细胞外的、细胞内的或它们的混合物。当产生的酶(类)是细胞外的，一般要得到它们首先将含酶上清液从微生物细胞中分离出来，然后用众所周知的方法，如沉淀、超滤和蒸发作用，从上清液中回收酶(类)。当产生的酶(类)是细胞内的时，首先，它们必须从细胞中脱离，这可以通过化学方法和/或机械方法来完成。一旦酶(类)放入溶液中，它们还可以采用上述已知方法进行回收。已知细胞外酶的组分和性质是不同于细胞内酶的，例如，细胞外酶的分子量一般比细胞内酶显著地要低。含有从细胞中脱离的细胞内酶的溶液，还包含大量其它胞内物料，这些物料不存在于含有细胞外酶的全发酵啤酒中。这些不同处可以形成对于它们的回收和纯化应用不同的工艺过程，甚至当它们都在水溶液中时亦如此。显然，适宜于细胞内酶的回收工艺过程对细胞外酶是无用的。为了改进生产和回收酶的效率和方便起见，已知可在含有聚乙醇和葡聚糖混合物的两相营养培养基中进行微生物发酵来生产酶。当发酵完成时，细胞外酶富集在面层聚乙二醇相中，而细胞和其它发酵产物富集在底层的葡聚糖相。这在《酶和微生物工程学》第7卷、333-338页(1985年)中已叙述了。在该体系中α-淀粉酶的分配系数有一个最大值，例如为4。在美国专利4，508，825号中叙述了上述工艺过程的变化。其中，含细胞外酶上清液与细胞分离，无细胞上清液与聚乙二醇和阳离子表囟代醇/聚胺共聚物或葡聚糖聚合物混合，以形成两相。这种技术可以用来分离胞外蛋白酶和淀粉酶，其中蛋白酶富集在聚乙二醇相，淀粉酶富集在阳离子共聚物或葡聚糖相。两相酶回收工艺过程也用于细胞内酶的回收，美国专利4，144，130号叙述了应用(1)未被取代的或取代的高分子量聚乙醇、聚醚、聚脂、聚乙烯吡咯烷酮或聚糖和无机盐的混合物，或(2)至少有两种上述高分子量聚合物的混合物，从水溶液回收细胞内酶，细胞内酶是从细胞中释放出来进入水溶液的。例如，当应用聚乙二醇和无机盐混合物时，所需细胞内酶进入面层聚乙二醇，而细胞碎片和其它发酵产物进入较低的含盐层。当处理全发酵啤酒时，在1，2-乙二醇中回收的各种酶的分配系数大约为0.3。当冻结细胞与水混合并被分离释放出酶时，分配系数约仅增加3。美国专利4，016，039号公开了增加聚乙二醇使无机盐加速无细胞上清液中酶的沉淀。在已有技术中没有任何迹象表明，聚乙二醇和无机盐可应用在两相方法中而从分配系数至少50的全发酵啤酒回收细胞外酶。根据本专利技术提供的从全发酵啤酒回收细胞外酶的工艺过程，包括(a)选自下列种类的聚合物聚乙二醇、聚乙二醇的胺衍生物、聚乙二醇的羧酸盐衍生物、聚丙二醇、聚丙二醇的胺衍生物、聚丙二醇的羧酸盐衍生物、聚(1，2-亚乙基二醇)酯、聚乙烯亚胺、三甲氨-聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和它们的混合物，和(b)无机盐的混合物，加到含有微生物细胞和细胞外酶的全发酵啤酒中，全发酵啤酒-聚合物-盐混合物可以分离成富酶的聚合物相和贫酶的盐相，并从此回收富酶产品。在上述技术中已知本专利技术的工艺过程用含有细胞外酶的全发酵啤酒作为原料。例如已知用地衣芽孢杆菌Amyloliquefaciens杆菌枯草杆菌和毛霉菌属miehei在适宜的营养培养基中生长，生产细胞外酶，如蛋白酶、淀粉酶和微生物粗制凝乳酶。在本专利技术的方法中可应用由细胞碎片、可溶细胞外酶和其它发酵产物形成的混合物，没有从可溶酶进一步分离细胞碎片。应用在此处的术语“细胞碎片”指的是整个细胞以及细胞片段。然后，全发酵啤酒与聚合物和无机盐混合形成两相系。所需的细胞外酶集中在聚合物相，而细胞碎片集中在盐相。适宜的聚合物包括聚乙二醇、聚乙二醇的胺衍生物、聚乙二醇的羧酸盐衍生物、聚丙二醇、聚丙二醇的胺衍生物、聚丙二醇的羧酸盐衍生物、聚(1，2-亚乙基二醇)酯、聚乙烯亚胺、三甲氨-聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和它们的混合物。最佳聚合物是聚乙二醇。可溶于含水全发酵啤酒的任何形式的聚乙二醇都是适宜的。特别有用的是分子量约3350的聚乙二醇。在室温下它是固态的。在商业生产规模上便于处理。无机盐可以是化合物，其中阳离子是钠、钾、镁和铵，阴离子是硫酸根、碳酸根、柠檬酸根、氯根、磷酸根及其它们的混合物。最佳盐类是氯化钠和硫酸钠。聚合物和无机盐加到全发酵啤酒，相当于组成总混合物，其中含有64-90%全发酵啤酒，1-15%聚合物和8-35%无机盐，所述百分率是根据混合物总重量的重量百分比。总混合物最好含有73-79%全发酵啤酒，3-4%聚合物和15-24%无机盐。添加聚合物和盐之后，就形成两相。聚合物相通常在盐相的上面，两相可以通过沉降形成，两相混合物可静止放置约5小时。然后，含酶聚合物相可以由任何标准的液-液分离技术，如虹吸和倾析洗涤法进行分离以回收酶。然而，最好应用离心分离技术分离两相，有效的分离器是连续无孔转鼓离心机。为了达到所要求的分离聚合物相最终的酶浓度，富酶聚合物相对贫酶盐相的容积比最好是0.12-0.15。为了最有效地回收细胞外酶，离心机操作应当使聚合物相中不夹带要被去除的盐相。结果是收集的聚合物相可能夹带一些混合在其中的盐相，然后，该混合物须经二次离心分离，在二次分离中，离心机操作使聚合物相中不夹带盐相，及在聚合物相中只夹带少量盐相。如此收集的富聚合物相可以直接用作酶源。例如在聚乙二醇相中回收的碱蛋白酶在酶洗涤剂配方中是适宜的。1，2-乙二醇可以有效地作为酶的稳定剂。如果需要，可以通过人们熟知的分离技术，如沉淀、超滤或蒸发从聚合物中分离出酶，以产生基本上无聚合物的酶产品。在本专利技术最佳实施例中，全发酵啤酒用1.5-5.0%氯化钙二水物、0.1-1.2%磷酸单钠或磷酸单钾和0-0.6%氢氧化钙的混合物预处理，所述的百分率是根据加到发酵啤酒容积的重量计算的重量容积百分比。当聚合物和无机盐连续添加时，预处理工序帮助结絮细胞碎片和改进酶从细胞碎片的分离。当回收蛋白酶时，预处理工序最好应用1.5-5.0%氯化钙二水物和0.2-1.2%磷酸单钠或磷酸单钾。当回收淀粉酶时，预处理工序应采用1.5-5.0%氯化钙二水物、0.1-1.0%磷酸单钠或磷酸单钾和0.1-0.6%氢氧化钙。在该技术中，已知分配系数作为分离效率的测定，分配系数表示为面层或聚合物相的酶活性浓度除以底层或无机盐相的酶活性浓度。每一相的酶活性可以通过已知技术测定。本专利技术工艺过程可以达到的分配系数至少为50，超过已知的现有技术，体现出显著的进展。下列实施例进一步详细叙述本专利技术。实施例1通过把下列组分加到6000加仑(22712升)发酵器制备适宜于生产碱蛋白酶的营养培养基麦谷蛋白 1500磅(681公斤)柠檬酸钠 165磅(74.9公斤)氯化钙二水物 165磅(74.9公斤)玉米淀粉 5000磅(2270公斤)大豆粉 2500磅(1135公斤)热稳定α淀粉酶 5磅(2.27公斤)磷酸单钠 400磅(181.6公斤)磷酸二钠 400磅(181.6公斤)防泡沫剂 16.5加仑(62.5升)水 加至6000加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从全发酵啤酒回收细胞外酶的方法，其中包括（ａ）选自下列种类的聚合物：聚乙二醇、聚乙二醇的胺衍生物、聚乙二醇的羧酸盐衍生物、聚丙二醇、聚丙二醇的胺衍生物、聚丙二醇的羧酸盐衍生物、聚（１，２－亚乙基二醇）酯、聚乙烯亚胺、三甲氨－聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和它们的混合物，与（ｂ）无机盐组成的混合物，加到含有微生物细胞和细胞外酶的全发酵啤酒中，全发酵啤酒－聚合物－盐混合物可以分离成富酶聚合物相和贫酶盐相，并从此回收富酶产品。

【技术特征摘要】
US 1985-9-4 775,031;US 1986-8-5 890,6201.一种从全发酵啤酒回收细胞外酶的方法，其中包括(a)选自下列种类的聚合物聚乙二醇、聚乙二醇的胺衍生物、聚乙二醇的羧酸盐衍生物、聚丙二醇、聚丙二醇的胺衍生物、聚丙二醇的羧酸盐衍生物、聚(1，2-亚乙基二醇)酯、聚乙烯亚胺、三甲氨-聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和它们的混合物，与(b)无机盐组成的混合物，加到含有微生物细胞和细胞外酶的全发酵啤酒中，全发酵啤酒-聚合物-盐混合物可以分离成富酶聚合物相和贫酶盐相，并从此回收富酶产品。2.根据权利要求1所述的方法，其中无机盐选自化合物类，其中阳离子是钠、钾、镁和铵，阴离子是硫酸根、碳酸根、柠檬酸根、氯根、磷酸根及它们的混合物。3.根据权利要求1所述的方法，其中全发酵啤酒、聚合物和无机盐的总混合物含有64-90%全发酵啤酒，1-15%聚合物和8-35%无机盐，所述百分率是根据混合物总重量的重量百分比。4.根据权利要求1所述的方法，其中全发酵啤酒、聚合物和无机盐的总混合物含有73-79%全发酵啤酒，3-4%聚合物和15-24%无机盐，所述百分率是根据混合物总重量的重量百分比。5.根据权利要求4所述的方法，其中聚合物是聚乙二醇，无机盐是氯化钠和硫酸钠的混合物。6.根据权利要求4所述的方法，其中聚合物是聚乙二醇，盐是硫酸钠。7.根据权利要求4所述的方法，其中聚合物是具有分子量约为3350的聚乙二醇。8.根据权利要求4所述的方法，其中在添加聚合物和无机盐混合物之前，全发酵啤酒与1.5-5.0%氯化钙二水物、0.1-1.2%磷酸单钠或磷酸单钾和0-0.6%氢氧化钙的混合物接触，所述的百分率是根据加到发酵啤酒容积的重量计算的重量容积百分比。9.根据权利要求8所述的方法，其中全发酵啤酒与1.5-5.0%氯化钙二水物和0.2-1.2%磷酸单钠或磷酸单钾的混合物接触。10.根据权利要求8所述的方法，其中全发酵啤酒与1.5-5.0%氯化钙二水物、0.1-0.6%氢氧化钙和0.1-1.0%磷酸单钠或磷酸单钾的混合物接触。11.根据权利要求4所述的方法，其中富酶聚合物相对贫酶盐相的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰克威廉布鲁尔，查尔斯埃弗雷特布拉泽斯，特里弗雷德法弗，金宗烈，李恩圭，
申请(专利权)人：詹伦卡国际印第安那州有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]