淀粉酶变体制造技术

本发明专利技术公开了一种亲本α－淀粉酶的变体，该亲本α－淀粉酶：（ｉ）具有选自分别在ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３和ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．７中所示氨基酸序列的氨基酸序列；或（ｉｉ）与这些氨基酸序列中的一种或多种显示出至少８０％的同源性；和／或显示出与如下抗体的免疫交叉反应性，所述抗体针对具有这些氨基酸序列之一的α－淀粉酶产生；和／或由如下ＤＮＡ序列编码，所述ＤＮＡ序列与编码具有这些氨基酸序列之一的α－淀粉酶之ＤＮＡ序列与相同的探针杂交；在这种变体中：（ａ）所说的亲本α－淀粉酶的至少一个氨基酸残基已被缺失；和／或（ｂ）所说的亲本α－淀粉酶的至少一个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基取代；和／或（ｃ）相对亲本α－淀粉酶而言至少有一个氨基酸残基已被插入；所说的变体具有α－淀粉酶活性并且相对于亲本α－淀粉酶表现出至少一种下列性质：增加的热稳定性；增加的氧化稳定性；和降低的Ｃａ↑［２＋］依赖性；其条件是所说的变体的氨基酸序列不与分别在ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１、ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ．２、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３和ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．７中所示氨基酸序列之任一相同。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及相对于亲本酶而言具有改良的性质(如，改良的热和/或氧化 稳定性和/或降低的钙离子依赖性)并由此改良了洗涤和/或餐具洗涤(和/或 纺织品去浆)性能的a-淀粉酶变体。本专利技术也涉及编码所说的变体的DNA 构建体以及携带DNA构建体的载体和细胞。本专利技术还涉及产生淀粉酶变体 的方法以及包含淀粉酶变体的去垢剂添加剂和去垢组合物。本专利技术还涉及 淀粉酶变体在纺织品去浆上的用途。
技术介绍
a-淀粉酶在工业上使用了很多年，用途很广，其中最重要的是淀粉液化、 纺织品去浆、在造纸和纸浆工业方面淀粉改性以及用于酿酒和烘烤。另一 个曰益重要的a-淀粉酶的用途是在洗涤或餐具洗涤期间除去含淀粉的污 垢。近年来试图构建具有对特定用途(如淀粉液化和纺织品去浆)的改良的性 质的a-淀粉酶变体。例如，美国5,093,257公开了包含嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶N-末端部分和地衣芽孢杆菌a-淀粉酶C-末端部分的嵌合a-淀粉酶。据记载，嵌合a-淀粉酶具有独特的性质，如与其亲本a-淀粉酶相比不同的热稳定性。然而， 所有具体描述的嵌合a—淀粉酶与其亲本a-淀粉酶相比表现出降低的酶促活性。EP252 666描述了通式为Q-R-L的杂种淀粉酶，其中Q是55至60个氨 基酸残基的N-末端多肽残基，它与已说明的解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶的57个N-末端氨基酸残基至少75%是同源的，R是已说明的多肽，L是包含390 至400个氨基酸残基的C-末端多肽，它与已说明的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶 的395个C-末端氨基酸残基至少75%是同源的。Suzuki等(1989)公开了嵌合a-淀粉酶，其中地衣芽孢杆菌a-淀粉酶的指 定区域已被解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶的相应区域替代。为了鉴别对热稳定 性起作用的区域，构建了嵌合a-淀粉酶。发现这样的区域包括解淀粉芽孢 杆菌a-淀粉酶的氨基酸残基第177-186和氨基酸残基255-270。在嵌合a-淀 粉酶中氨基酸残基的改变似乎不影响酶除其热稳定性以外的性质。WO 91/00353公开了至少一个氨基酸残基与其亲本a-淀粉酶不同的a-淀 粉酶突变体。在所说的专利申请中公开的a-淀粉酶突变体由于其氨基酸取 代应用于淀粉降解和/或纺织品去浆表现出改良的性质。 一些突变体表现出 稳定性提高，但是没有报道或指出酶促活性的改进。仅作为例子说明的突 变体从亲本地衣芽孢杆菌a-淀粉酶制备，它携带下列突变之一H133Y或 H133Y+T1491。已推荐的另 一个突变是A111T。FR 2,676,456公开了地衣芽孢杆菌a-淀粉酶的突变体，其中在组氨酸133 附近的一个氨基酸残基和/或丙氨酸209附近的一个氨基酸残基已被一种更 疏水的氨基酸残基取代。据记载，产生的a-淀粉酶突变体具有改良的热稳 定性，在纺织品、造纸、酿酒和淀粉液化工业中是有用的。EP285 123公开了进行核苦酸序列随机诱变的方法。作为这样的序列的 一个例子提到了编码嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶的核苷酸序列。当突变时， 获得了在低pH值下具有改良的活性的a-淀粉酶变体。在上述参考中没有一个提到甚至暗示可以构建对去垢剂工业来说有改 良的性质的a-淀粉酶突变体。EP525 610涉及具有对离子表面活性剂(表面活性剂)改良的稳定性的 突变体酶。突变体酶通过亲本酶的表面部分的一个氨基酸残基已被另一种 氨基酸残基取代产生。在EP525 610中具体描述的唯一突变体酶是蛋白酶。 淀粉酶作为可获得对离子表面活性剂改良的稳定性的酶的例子被提到，但 是淀粉酶的类型、起源或具体突变都没指明。WO 94/02597公开了在氧化剂存在下表现出改良的稳定性和活性的a-淀粉酶突变体。在突变体a-淀粉酶中， 一个或多个曱硫氨酸残基已被不同于半胱氨酸和曱硫氨酸的氨基酸残基取代。据记载，a-淀粉酶突变体可用 于去垢剂和/或餐具洗涤添加剂以及纺织品去浆。W0 94 18314公开了对氧化稳定的a-淀粉酶突变体，包括在地衣芽孢杆 菌a-淀粉酶Ml97位置的突变。EP 368 341描述了与/不与用于洗涤和餐具洗涤的a-淀粉酶组合的支链 淀粉酶和其它淀粉分解酶。本专利技术的一个目的是提供a-淀粉酶变体，该变体相对于其亲本a-淀粉酶 具有改良的重要性质，特别是有关所说的变体的洗涤和/或餐具洗涤性能， 例如，增加的热稳定性、增加的氧化稳定性、降低的对Ca^离子的依赖性 和/或在适当的pH值区域中(例如，洗衣或餐具洗涤)改良的稳定性或活性。 这样的变体a-淀粉酶有优势，其中，它们可以在比其亲本a-淀粉酶更低的剂 量下使用。而且，a-淀粉酶变体可以除去含淀粉的污垢，而此污垢不能(或 有困难)用目前已知的a-淀粉酶去垢剂酶除去。专利技术的筒要说明作为本专利技术基础的工作的目的在于改良(如果可能的话)a-淀粉酶(特别 是，具体来说可从芽孢杆菌菌抹获得的a-淀粉酶)的稳定性，这些a-淀粉酶粉的性能为基础相对于目前市售的a-淀粉酶选择。在这方面，本专利技术的发 明人令人惊奇地发现事实上有可能通过亲本a-淀粉酶的氨基酸序列的不 同区域的一个或多个氨基酸残基的合理修饰来改良这样的亲本a-淀粉酶的 上述类型(见上)的性质。本专利技术以此发现为基础。因此，本专利技术的第一个方面涉及亲本a-淀粉酶的变体，所说的亲本a-淀粉酶是一种i) 具有分别在本文的SEQIDNo.l、 SEQIDNo.2、 SEQ ID No.3和SEQ IDNo.7中所示的氨基S^f列之一；或ii) 与在SEQ ID No. 1 、 SEQ ID No.2 、 SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所 示的一种或多种氨基SL^列表现出至少80%的同源性；和/或显示出与由抗 具有分别在SEQIDNo.l、 SEQIDNo.2、 SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所 示的氨基酸序列之一的a-淀粉酶产生的抗体的免疫交叉反应性；和/或由与编码具有分别在SEQ ID No.l 、 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3和SEQ ID No.7 中所示的氨基酸序列之一的a-淀粉酶之DNA序列相同的揭:针杂交的DNA 序列编码。本专利技术的a-淀粉酶变体所符合的条件为该变体是氨基酸序列不与在 SEQIDNo.l 、 SEQIDNo.2、 SEQIDNo.3或SEQIDNo.7中所示的氨基酸 序列相同的变体。编码所述的前三个a-淀粉酶氨基酸序列的DNA序列在SEQ ID No.4(编 码在SEQ ID No.l中所示的氨基断列)、SEQ ID No.5(编码在SEQ ID No.2 中所示的氨基酸序列)和SEQ ID No.6(编码在SEQ ID No.3中所示的氨基酸 序列)中显示。在WO 95/26397中也公开了 SEQ ID No.l和SEQ ID No.2亲本a-淀粉酶 的氨基酸序列和相应的DNA序列(分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)(和 本专利申请的SEQ ID NOs.相同)。本专利技术的变体是这样的变体，其中(a)所说的亲本a-淀粉酶的至少一个 氨基酸残基已被缺失；和/或(b)所说的亲本a-淀粉酶的至少 一个氨基酸残基 已被不同的氨基酸残基取代；和/或(c)相对亲本a-淀粉酶而言至少有一个氨 基酸残基已被插入；所说的变体具有a本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亲本α－淀粉酶的变体，该亲本α－淀粉酶：（ｉ）具有选自分别在ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３和ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．７中所示氨基酸序列的氨基酸序列；或（ｉｉ）与这些氨基酸序列中的一种或多种显示出至少８０％的同源性；和／或显示出与如下抗体的免疫交叉反应性，所述抗体针对具有这些氨基酸序列之一的α－淀粉酶产生；和／或由如下ＤＮＡ序列编码，所述ＤＮＡ序列与编码具有这些氨基酸序列之一的α－淀粉酶之ＤＮＡ序列与相同的探针杂交；在这种变体中：　（ａ）所说的亲本α－淀粉酶的至少一个氨基酸残基已被缺失；和／或　（ｂ）所说的亲本α－淀粉酶的至少一个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基取代；和／或　（ｃ）相对所说的亲本α－淀粉酶而言至少有一个氨基酸残基已被插入；　所说的变体具有α－淀粉酶活性并且相对于所说的亲本α－淀粉酶表现出至少一种下列性质：增加的热稳定性；增加的氧化稳定性；和降低的Ｃａ↑［２＋］依赖性；　其条件是所说的变体的氨基酸序列不与分别在ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３和ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．７中所示的氨基酸序列之任一相同。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：H比斯加德佛兰茨，A斯文森，TV伯切尔特，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]