【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于生产各种限制性酶类和/或修饰性酶类的无性系，即生产这些无性系的方法及从这些无性系中生产限制性和/或修饰性酶类的方法。本专利技术特别涉及到HaeⅡ限制性核酸内切酶和修饰性甲基化酶以及TagⅠ限制性核酸内切酶和修饰性甲基化酶的无性系，还涉及到生产这些无性系和酶类的方法。限制性核酸内切酶是一种天然地有在于细菌中的酶类，当这些酶从其他污染的细菌成份中纯化出来时，可以用于实验室，把DNA分子切成各种精确的片断。这种特性能使DNA分子被准确无误地识别，并被切割成组成它们的各种基因。已证明限制性核酸内切酶是现代遗传学研究上不可缺少的工具。这种酶类是生物化学的“剪子”，用其来进行遗传工程和分析。限制性核酸内切酶是沿着DNA分子在识别和把其连结到特殊的核苷酸序列(‘识别序列’)上时起作用的。一旦结合上，这种酶就在认别序列的内部或一侧把这种DNA分子切开。不同的限制性核酸内切酶有对不同识别序列的亲和性。在迄今为止调查研究过的成千上石种的细菌中，已鉴定了将近百种不同限制性核酸内切酶。每一细菌种属最多只含有少数几种限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶原则上是根据获得它们的细菌种的名称来命名的。例如，埃及嗜血杆菌属(Haemophilus aegyptius)合成三种不同的限制性核酸内切酶，被命名为HaeⅠ，HaeⅡ和HaeⅢ。这三种限制性核酸内切酶分别识别和切开(AT)GGCC(AT)，Pu GCGCPy和GGCC序列。另一方面，大肠杆菌Ry13(Escherichia Coli Ry13)仅合成一种酶E.CORⅠ，它是识别GAATTC序列的。...
【技术保护点】
克隆限制性基因的方法，包括构成一个含有这种限制性基因编码的ＤＮＡ的库，分离含有这种修饰性基因无性系和筛选含有修饰性基因又同时存在限制性基因的克隆。
【技术特征摘要】
US 1985-3-1 707,079;US 1986-2-6 826,892中指出的外，不要把其看作是受限制的。实例ⅠHaeⅡ限制性-修饰性基因的克隆按照上述的供克隆限制性基因的方法，图1为HaeⅡ甲基化酶的克隆图解。制备HaeⅡ无性系步骤如下1.DNA的提纯为了制备埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegy-ptyius)的DNA(ATCC11116)，把5克新鲜生长的细胞团重悬于20ml的25%蔗糖、50mM Ttis(PH＝8.0)溶液中。再加入10ml0.25MEDTA(PH＝8.0)和6.0ml浓度为10mg/ml的溶菌酶(溶于0.25M Ttis中，PH＝8.0)。悬浮液放于冰上二小时。然后，加进24ml溶胞作用混合液(1% Triton X-100、50mM Tris〔PH＝8.0〕、67mM EDTA)和5ml 10% SDS，混匀，使其细胞发生溶胞作用。然后加入70ml刚平衡好的(苯)酚，摇荡使溶液乳化。再加入70ml氯仿，摇荡使溶液再乳化。然后使这种混合液在10Krpm下离心30分钟，把上层含有DNA的粘溶液转移到新的容器里，用酚/氯仿重新抽提二次以上。把上层的DNA溶液转移到透析管中对1倍(1X)DNA缓冲液(10mM Tris、1mM EDTA、PH＝8.0)透析，换液四次，24小时以上。把透析过的DNA溶液转移到烧杯中，加入1/100体积的浓度为10mg/ml的RNase(核糖核酸酶)使RNase的最终浓度达100μg/ml。把这种溶液在37℃下温育1小时以便消化RNA。然后加入5M Nacl，使其最终粘度为0.4M，再加入0.55体积的异丙醇且使其在溶液的顶部成层。用玻璃棒把DNA缠绕出混合液，然后溶解在15ml的1XDNA缓冲液中，存放于4℃。2.部份消化用HindⅢ滴定这种纯化过的DNA以便达到部份消化作用。步骤如下把溶在10mM Tris PH7.5、10mM Mgcl2、50mM Nacl、10mM巯基乙醇缓冲液中的2.0ml DNA(浓度为100μg/ml)分配成十管，每管200μl。在第一管中加入40个单位的HindⅢ，使达到每微克(μg)DNA有2个单位HindⅢ。在第二管中加入20个单位的HindⅢ(1单位/微克)，如此类推，即每后面的管只接受前管的一半量HindⅢ。把这些试管于37℃温育1小时，然后在72℃加热处理15分钟。从每管中取出10μl这种溶液作琼脂糖凝胶电泳分析。选择消化作用适中但不完全的这些管中的内容物，作为供克隆用的部份消化的片断来源。(这些管是0.13单位/μg和0.06单位/μg的管。把这两种溶液混合一起用法如下述)。3.连接把DNA片断连接到pBR322上，步骤如下;把用4.0μg HindⅢ部份消化的埃及嗜血杆菌(H.aegyptius)的DNA(40μl)与用2.0μg HindⅢ切开和去磷酸化的pBR322(10μl)混合一起。加入10μl 10X连接作用混合液(500mM Tris〔PH7.5〕、100mM Mgcl2，100mM DTT，5mM ATP)和40μl无菌蒸馏水，使其达到最终体积100μl。再加入5μl的T4DNA连接酶，且把这种混合液于16℃温育4小时。然后，用10份10μl量来转化E.coli RRI株系，步骤如下在冰上，使每份10μl此溶液与100μl的SSC/Cacl(50mM Nacl、5mM Na3Citrate(柠檬酸钠盐)67mM Cacl2)混合起来，再加入200μl冰冷的有活力的E.coli RRI株系的细胞。在43℃下加热摇振2分钟后，再把这种细胞稀释入5ml的Luria-肉汁(L-broth)中，在37℃下生长至饱和态。4.初到细胞库离心转化的细胞培养物，重新把其悬浮于250μl体积，平面培养在含有100μg/ml浓度氨苄青霉素的Luria-琼脂(L-agar)平皿上。在37℃下温育过夜后，用2.5ml的10mM Tris(PH7.5)、10mM Mgcl2溶液冲洗每块琼脂培养皿，把转化的菌落细胞收集一起，形成初级细胞库。5.初级质粒库初级质粒库用如下步骤制备把2.5ml初级细胞库接种到500ml的含有100μg/ml氨苄青霉素的L-肉汁中。培养液在37℃下摇振过夜后，在4Krpm下离心5分钟。弃去上清液，在室温下把其细胞沉淀团重悬于10ml 25%蔗糖、50mM Tris(PH8.0)液中。加入5ml 0.25M EDTA(PH8.0)，接着加入3ml的、溶于0.25M Tris(PH8.0)的浓度为10mg%ml的溶菌酶。把这种溶液放在冰上1小时，然后用吸管移入12ml溶胞混合液(1% Triton X-100、50mM Tris〔PH8.0〕、67mM EDTA)中，且轻轻地混旋细胞悬浮液达到溶胞作用。溶胞后，把其混合液转移到50ml的塑料离心管中，在4℃下17Krpm离心45分钟。用吸管吸出上清液。称20.0克固体Cscl(氯化铯(放入一个50ml的有螺幅的塑料管中，用吸管移入22.0ml上清液于此管中，混合。再加入1.0ml浓度为5mg/ml的溴乙啶溶液(溶在10mM Tris〔PH8.0〕、1mM EDTA、100mM Nacl液中)。于混合物把此溶液转移到3/8英寸×3英寸的异质同晶聚合物(polallomer)离心管中，封闭好。然后在Ti70转子上在17℃下50Krpm离心42小时。为了收集这种质粒，用外科解剖刀把此管的顶部刺破且在紫外光下用注射器收集两条中较低的呈荧光的DNA带。把两个管中的较低的DNA带合拼一起移入有螺帽的玻璃管中，用等体积的冰冷N-正丁醇抽提4次除去溴乙啶。把抽提过的溶液移入做成的透析管中，对1X DNA缓冲液透析换液4次，24小时。然后把透析过的DNA溶液转移到一个预先称重的、50ml的无菌离心管中，且测量此溶液的体积。加入5M Nacl液、使其最终浓度达0.4M。然后加入2倍体积的异丙醇，混合。把此溶液存放于-20℃下过夜，沉淀DNA。沉淀后，溶液在0℃下15Krpm离心15分钟，弃掉上清液。把离心管放置于工作台上空气干燥15分钟，然后加入750μl消毒蒸馏水。沉淀块溶解后，再加入8μl 100X的DNA缓冲液，然后把这种溶液移到一种Eppendorf管中，储放于-20℃。以这种方法制备的质粒DNA浓度大约100-200μg/ml。6.质粒库的消化消化初级质粒库以便破坏那种非HaeⅡ甲基化酶无性系，步骤如下让质粒DNA在10mM Tris PH7.5、10mM Mgcl2、10mM巯基乙醇、50mM Nacl缓冲液中稀释成浓度为50μg/ml。制备总量为500μl且把其分配到5支试管中，每支试管100μl。在第一试管中加入75单位的HaeⅡ使达到15个单位/微克DNA，第二管加入38单位HaeⅡ，如此类推，即每后管含有前一管的一半量HaeⅡ。把这些试管37℃温育1小时。7.转化用前面叙述的方法，从每管中取出10μl样品作为转化克RRI用。把这种细胞/DNA混合物加热后不经过中间稀释和生长立即培养在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平皿上，在37℃下温育过夜后，检测此平皿。发现经HaeⅡ消化的质粒库中的转化子的数量(即是完整无损质粒的数量)约减少了102倍。从后面的实验得知，加入2.5个单位核酸外切酶、Ⅲ(新英格兰生物实验室股份有限公司，也可从巴特威克研究所(BRL)和IBI处得到)或入一核酸外切酶到前叙(第6节)的各支消化管中时，会增强非甲基化酶无性系的这种破坏作用，使转化子的数量减少了103-104倍左右。从经受过最大消化作用(加入15个单位HaeⅡ/μg和7.5单位HaeⅡ/μg，加或不加核酸外切酶)的平板培养物上存活下来的菌落中，大约能挑选出30单菌落。把每个菌落都接种到含有氨苄青霉素的10ml L-肉汁中以便制备微量培养物，并在含有氨苄青霉素的L-琼脂平皿上划线培养，以便准备主料(a masfer sfook)。8.次级群体把剩余的菌落收集一起形成次级细胞库。用上述制备初级质粒库的那种方法来制备次级质粒库。9.次级质粒库的分析在这种特别实验中，没有再进一步利用这种次级HaeⅡ库。然而，按常例，用消化作用和凝胶电泳方法是有助于分析次级质粒库的。这样的分析可能有助于确定占明显比例的这种群体是否携带有共同片断，并显示出对限制性核酸内切酶消化作用的抗性。10.次级个体的分析在这种次级细胞个体中，大约有30个存活下来的菌落生长成10ml的培养物(参看第7节)。由Birnboin和Doly的方法(Nucleie Aeid Res。(核酸研究)71513〔1979〕)改进的下述微量物纯化的程序来制备这种细胞所携带的质粒。微量物制备程序用如下步骤处理每种培养物生长过夜的10ml培养物在8Krmp下离心5分钟沉淀下来。弃掉上清液，把细胞沉淀块重新悬浮于1.0ml含有1mg/ml浓度溶菌酶的混合液中(25mM Tris、10mM EDTA、50mM葡萄糖、PH＝8.0)。室温放置10分钟后，加入2.0ml 0.2M NaoH1% SDS溶液，振摇使细胞发生溶胞作用，然后放置于冰上。一旦待此溶液变清，就加入1.5ml 3M乙酸钠溶液(PH4.8)且振摇。出现的沉淀在4℃下15Krpm离心10分钟。把其上清液倒入一个含有3ml异丙醇的离心管中，混匀。室温下10分钟后，15Krpm离心10分钟使核酸沉淀。倒掉上清液，室温下让空气干燥此沉淀物30分钟。一旦干燥，就把此沉淀块重悬溶于850μl10mM Tris、1mM EDTA液中(PH8.0)。再加入75μl5MNacl，接着，把这种溶液转移到一个盛有575μl异丙醇的Eppen-dorf管中，在室温下再沉淀10分钟。然后在微型离心机上离心45秒种，弃掉上清液，空气干燥此沉淀块。然后，把沉淀块溶解在50μl的含有100μg/ml浓度的RNase中(溶于10mM Tris、1mM EDTA液中(PH8.0)，在37℃下温育1小时以便消化其RNA。加入50μl5M Nacl，随后加入350μl异丙醇来再次沉淀其DNA。室温10分钟后，离心45秒钟，使DNA沉淀下，弃掉上清液，使沉淀块重溶于150μl 10mM Tris、1mM EDTA(PH8.0)的终溶液中。接着通过HindⅢ和HaeⅡ的消化作用分析这种质粒微量制备物。11.甲基化酶基因无性系发现许多被分析过的这种质粒都随机地携带有Haemophilus(嗜血杆菌)的DNA的HindⅢ片断，而且对HaeⅡ的消化作用很敏感。这些质粒都是不能进一步利用的假的存留者。(发现，这些假的质粒，在以后采用核酸外切酶消化的实验中，用HaeⅡ进行选择消化阶段就明显地减少了)。然而，发现那种残留下来的质粒既对抗HaeⅡ又至少携带长度大约为3.1千碱基对和2.9千碱基对的两个HindⅢ片断。后来，这类质粒表明它们既携带有HaeⅡ修饰性甲基化酶基因，又带有限制性核酸内切酶基因。在一系列平行的实验中，也选择和分离出携带有HaeⅡ甲基化酶基因的无性系(图1)。发现这些无性系带有大约4.8千碱基对的HindⅢ片断。已分离出几个既带有HaeⅢ甲基化酶基因，又带有HaeⅡ甲基化酶基因的无性系，而且得知这些无性系既带有4.8千碱基对片断又带有二个3.1千碱基对的和2.9千碱基对的片断。后面的这些无性系的分离表明，在埃及嗜血杆菌(H.aegyptius)中，这种HaeⅡ限制性基因和HaeⅡ修饰性基因至少是与HaeⅢ甲基化酶基因连接着的。没有分离到携带在HaeⅢ限制性基因的无性系。图2是是HaeⅡ限制性/修饰性无性系和HaeⅢ修饰性无性系的HindⅢ一消化物凝胶照片的复制图。图3概述了从此凝胶照片和一些相似的分析中推断出这类无性系的组成。至少携带有3.1千碱基对和2.9碱基对的HindⅢ片断的这类无性系(HaeⅡ4m-1，4-8，4-9，4-10，4-5，4-11，4-3等)，根据(a)对HaeⅡ限制性核酸内切酶的消化作用不敏感和(b)在体外对HaeⅡ限制性甲基化酶活性的测定结果，被判断都携带有HaeⅡ甲基化酶基因。甲基化酶的测定按以下步骤操作甲基化酶的测定为了测定甲基化作用，需要制备以下三种溶液10×甲基化作用缓冲液0.5M Tris PH7.5、100mM EDTA、50mM巯基乙醇。甲基化作用反应混合液新鲜配制，供分析一种无性系用100μlλDNA(浓度500μg/ml)，100μl10X甲基化作用缓冲液，1μl 100mMS-腺苷甲硫氨酸，800μl蒸馏水。2X HaeⅡ转化缓冲液50mM Nacl、40mM Mgcl2、15mM巯基乙醇。用以下步骤制备细胞抽提物把100ml供检测的无性系培养物加入含有100μg/ml浓度氨苄青霉素L-肉汁中37℃生长过夜，并在4Krpm下离心5分钟，使其细胞沉淀。弃掉上清液，把沉淀块重新悬浮于5ml的起声缓冲液中(10mM Tris〔PH7.5〕、10mM巯基乙醯、1mM EDTA)。悬浮后，加入0.5ml含有10μg/ml浓度溶菌酶的超声缓冲液。此悬浮液被混旋且放置冰上1小时。取1ml样品转移到Eppendorf管中，温和超声处理二次、每次10秒钟，使细胞破裂。在微型离心机上离心30秒钟，此上清液用作细胞抽提物。为了测定该抽提物，把甲基化反应混合液分配到5支试管中。第一管150μl，其余的4管每管102.5μl。在第一管中加入7.5μl细胞抽提液，混匀，然后取出47.5μl加入到第二管中，混匀，以此类推。因此，在第一管中每微克DNA接受了1μl细胞抽提液，而第二管中的每微克DNA接受了0.3μl细胞抽提物，第三管为0.1μl抽提物/μg DNA，等等，现在每支试管都有100μl溶液。把它们温育于37℃下1小时，然后加热到72℃10分钟以便停止反应。在每一管中加入100μl2X转化缓冲液和25单位HaeⅡ限制性酶。再把这些溶液温育于37℃下1小时，然后用凝胶电泳法分析每管中的20μl样品。发现，这类无性系的每克湿重细胞胶状物能合成大约5000单位的HaeⅡ甲基化酶。12.限制性基因无性系还发现上面(第11节)鉴别过的、携带有HaeⅡ修饰性甲基化酶基因的这类无性系也带有HaeⅡ限制性核酸内切酶基因。这是在体外通过核酸内切酶的测定得知的。操作如下核酸内切酶的测定为了测定核酸内切酶的活性，需要制备以下两种溶液10X HaeⅡ限制性核酸内切酶缓冲液100mM Tris(PH7.5)、100mM Mgcl2、100mM巯基乙醇、500mM Nacl。消化反应混合液新鲜制备供分析1种无性系用100μlλ-DNA(500μg/ml)、100μl 10XHaeⅡ限制性核酸内切酶缓冲液、800μl蒸馏水。以上面(第11节)叙述的方法制备供甲基化作用测定用的细胞抽提物。为了测定此抽提物，把消化反应混合液分配到6支试管中，第一管150μl，其余5管每管102.5μl。在第一管中加入7.5μl抽提物，混合，从中取出47.5μl加入下一管，混匀，以此类推。因此第一管中的每微克DNA接受1μl细胞抽提物，第二管中每微克DNA接受0.3μl抽提物，第三管为0.1μl抽提物/μgDNA，等等。现在，每管都含有100μl内容物。把这些管温育于37℃下1小时，然后用凝胶电泳法分析各管中的20μl样品。发现这类无性系的每克湿重细胞胶状物能合成大约3000单位HaeⅡ限制性核酸内切酶。在用噬菌体作试验时，发现这类无性系只轻度地抵抗噬菌体的感染得知λ噬菌体的平面培养效率是在0.1-0.5之间。(无性系4m-1〔图2和3〕例外。在无性系4m-1上其λ噬菌体的平面培养的效率低于10-4)。实例ⅡHaeⅡ限制性基因和修饰性基因的高效表达1.在实例1中获得一个无性系叫做pHaeⅡ4-11(图3和4)，用作进一步分析和高效表达，因为这种无性系具有最简单的结构。图4表明在这个无性系中插入的两个HindⅢ片断的简化的限制性图谱。这个图谱是通过常规的双酶解程序来确定的。2.为了实现高产(图5和6)而设计两个不同步骤。这两个步骤涉及到把HindⅢ连接到一种含有强有力的启动子调节成份上，以至于当这种启动子被解阻遏时，这种限制性基因和修饰性基因就以异常高的速率转录。这种高效表达系统以前曾描述过。3.第一步，在一个片断上用HaeⅢ切除与一用段末端为pBR322DNA连接在一起的HindⅢ片断来切开这种4-11质粒。用BamHⅠ消化其载活pGW7(美国菌种保存中心〔ATCC〕，40166，也可从新英格兰生物实验室获得)且用DNA聚合酶充填其BamHⅠ粘性末端。对于HaeⅡ质粒而言，让12.5μg质粒DNA与80单位HaeⅢ限制性核酸内切酶在10mM Tris(PH7.5)、10mM Mgcl2、10mM巯基乙醇、50mM Nacl液中混合，并使其最终体积达500μl。对于pGW7质粒而言，让12.5μg质粒DNA与80单位BamHⅠ限制性核酸内切酶在相同的缓冲液中混合，但其最终体积为250μl。把这两种消化物37℃温育1小时，然后在72℃下加热10分钟以终止其消化，随后用聚合酶充填这种BamHⅠ消化物。作法如下在100μl BamHⅠ消化液中加入30μl 5XdNTP贮存液(25mMdCTP、25mMdGTP、25mMdTTP)，5μl 10X聚合酶缓冲液(100mM Tris〔PH7.5〕、100mM Mgcl2、10mM DTT，500mM Nacl)、7.5μl蒸馏水和7.5μl大片断DNA聚合酶。把这种反应溶液于20℃温育反应15分钟，然后，取出4.5μl此液与45μl4-11质粒消化液、10μl 10X连接作用混合液(在实例Ⅰ第三节叙述过)和5μl T4DNA连接酶一起混合。把这种连接反应溶液于20℃温育3小时。然后，取出10μl这种连接作用液转化E.Coli RR1且平面培养在含有氨苄青霉素L-琼脂平皿上。该培养平皿在30℃下温育过夜把整个连接作用液做成8个培养平皿S每个平皿约有250个菌落把整个连接作用液做成8个培养平皿，每个平皿约有250个菌落，即是说，总共约有2000个重组体。把这些培养物收集一起，用前述制备初级质粒库那样的方法(参看实例1的第4节第5节)制备质粒库。用HaeⅡ限制性核酸内切酶消化这种质粒库，以便有选择地破坏不携带HaeⅡ修饰性基因的重组质粒。(在每一种消化作用物中加入2.5单位核酸外切酶Ⅲ以降低假存活体的本底)。接着转化E.Coli RRⅠ，将其平面培养于含有氨苄青霉素的L-琼脂平皿上。在30℃下温育，挑选出存活的菌落，并用微量制备方法(参后实例Ⅰ第10节)纯化这些菌落所携带的质粒，然后用消化和凝胶电泳法分析这些质粒。图5概述了整个实验设计且表示一些存活体消化物的凝胶电泳图谱。用这种方法分离的一个叫做pHaeⅡ7-11的无性...
【专利技术属性】
技术研发人员：杰弗里格雷厄姆威尔逊，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。