本发明专利技术公开了一种用于检测人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor‑2，HER‑2)的核酸序列及试剂盒，属于分子诊断技术领域。本发明专利技术提供的检测HER‑2的引物及探针能特异地扩增并检测HER‑2基因的扩增。本发明专利技术还公开了一种基于微滴式数字PCR系统的检测HER‑2基因的检测试剂盒，能实现快速、灵敏、准确的检测HER‑2基因的扩增。本发明专利技术具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，可用于临床HER‑2基因扩增的快速检测，为临床人表皮生长因子受体2的诊断和治疗提供参考依据。
【技术实现步骤摘要】
一种用于HER-2基因拷贝数扩增检测的核酸序列、试剂盒及其应用
本专利技术属于分子诊断
，具体涉及一种用于HER-2基因拷贝数扩增检测的核苷酸序列、试剂盒及其应用。
技术介绍
人表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，HER-2)基因位于染色体17q12-q21，其编码产物为185kD的跨膜精蛋白p185，由1255个氨基酸组成，720-987位属于酪氨酸激酶区。HER-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜糖蛋白，是表皮生长因子受体(EGFR)家族成员，与EGFR高度同源。研究证实，HER-2介导的信号传导与多种肿瘤的形成、增殖、转移、侵袭及放化疗耐药有关。以往其相关研究多集中于乳腺癌和卵巢癌。近年的研究显示，HER-2在胃癌中也存在高表达，有望成为一个新的基因治疗靶点。原瘤基因HER-2/neu的研究是当前研究的热点之一。目前女性乳腺癌中,有25％～30％的病人有这种基因扩增。文献报道15％～20％的浸润性乳腺癌和多达60％的导管原位癌有HER-2/neu基因和蛋白的表达。大规模研究证实HER-2阳性的肿瘤不仅其预后较差，而且复发的风险显著增加，主要表现在基因扩增与乳腺癌的复发、转移有关。近年来，随着医疗技术的进步，以HER-2为靶点的靶向治疗药物——曲妥珠单抗(罗氏制药，中文商品名：赫赛汀)。该药物通过抑制细胞活化信号的传递,用于治疗HER-2高表达的乳腺癌患者，不仅显著减少了肿瘤的转移和复发率，也提高了患者的生存质量。随机对照临床研究已证实，抗HER-2单克隆抗体曲妥珠单抗联合化疗在HER-2过表达晚期胃癌中的疗效显著优于单纯化疗。赫赛汀以HER-2为治疗靶点，若要筛选可受益于赫赛汀治疗的患者，必须进行HER-2基因检测。对于乳腺癌的治疗和预后均具有重要意义。目前，临床上检测HER-2状态的常用方法有免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)和荧光原位杂交法(fluorescenceinsituhybridization，FISH)。IHC是基于抗体在蛋白(基因产物)水平上检测HER-2的状态，该法易于开展，已被广泛使用，但技术本身受组织固定、抗原修复、一抗的灵敏度和特异度、染色结果评定等多种变量的影响，使得结果不够准确和稳定，尤其对HER-2轻、中度表达的样本易产生假阴性。FISH是基于探针直接在DNA(基因)水平上检测HER-2的状态，该法灵敏、准确、可靠，结果具有高度的可重复性。但FISH依赖于制作的探针质量和样本前期制片质量，同时还受17号染色体多倍体干扰，且检测流程长，操作复杂，结果分析困难，技术难度和成本均较高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种操作简便、结果准确、成本低廉和高通量的新型HER-2基因扩增检测试剂盒，满足临床HER-2诊疗需求。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种用于特异检测HER-2基因扩增的引物和探针，具体包括如下：(1)扩增HER-2基因扩增的引物序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示；(2)扩增HER-2基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；(3)扩增21-TFF3-S基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：4～5所示；(4)扩增21-TFF3基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；(5)扩增21-TFF3-L基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：7～8所示；其中，HER-2探针SEQIDNO：3序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，21-TFF3基因探针SEQIDNO：6序列的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团。上述8条核酸序列在一次2孔检测中使用。本专利技术还公开一种用于检测HER-2基因扩增的试剂盒，包括如下试剂组分：(1)2*supermix：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP等；(2)引物探针预混合液：将SEQIDNO：1～8所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，每条探针的浓度为10μM；1～3各核酸序列的母液以9:9:25的比例混合；4～6各核酸序列的母液以9:9:25的比例混合；6～8各核酸序列的母液以25:9:9的比例混合，最终形成引物/探针在反应体系中的浓度为900/250nM。(3)阳性对照：FISH检测为HER-2基因簇状扩增的福尔马林浸泡的石蜡组织样本(FFPE)；(4)阴性对照：FISH检测为HER-2基因不扩增的福尔马林浸泡的石蜡组织样本(FFPE)。本专利技术的另一技术方案为：将HER-2基因扩增检测试剂盒，用于临床FFPE样本HER-2基因扩增检测，主要步骤如下：1)抽提FFPE中的DNA；2)用上述设计的试剂盒进行HER-2基因扩增检测。3)将扩增完毕的PCR板放入微滴读取仪，对每一扩增完的样本进行微滴读取仪的荧光分析，在阴阳性对照结果正常的前提下，分别计算样本反应孔中HER-2基因拷贝数(FAM通道，蓝色荧光)/21-TFF3-S基因拷贝数(VIC通道，绿色荧光)和HER-2基因拷贝数(FAM通道，蓝色荧光)/21-TFF3-L基因拷贝数(VIC通道，绿色荧光)，最终得出样本中HER-2基因的准确扩增状态。作为优选，所述扩增体系如下：2*supermix10μl，引物探针预混合液2μl，标本抽提模板DNA8μl，总体系20μl；所述PCR扩增条件为：95℃10min；40个循环(94℃15s，55℃60s)，98℃10min；4℃，hold。本试剂盒的有益效果：1)本专利技术中采用一种基于微滴式数字PCR系统的检测体系，将每一样本的20μl反应液通过乳化分成20000个独立的微滴，对浓度较低的样本来说，每个微滴中包含的HER-2或21-TFF3拷贝数为1或0，通过专用软件自动检测每个微滴的荧光信号，再计数总的阳性微滴数，就能得到准确的HER-2拷贝数，浓度较高的样本只需进行一定比例的稀释，也能得到准确的结果。2)目前临床上乳腺癌标本应用IHC+FISH相结合的检测方法，其中IHC2+为HER-2不确定病例，需进一步应用FISH的方法进行HER-2基因扩增状态检测，其中占比约30～40％的样本，而本专利技术中设计引物和探针时，设计了三对引物和探针序列，采用两条不同长度的引物(21-TFF3-S、21-TFF3-L)分别与HER-2基因组合双孔双通道检测，可以将不确定的比率降低至10％左右，很大程度上减少了FISH检测的成本；同时对于数字PCR方法检测出的阳性和阴性结果的样本，可以直接发布结果，最大程度的提高了发布报告的时间，为临床医生提供快速、准确的辅助用药指导。3)本专利技术所述的试剂盒及微滴式的数字PCR检测系统配制简单，整个流程自动化程度高，效果好，操作非常简便易上手，适宜临床应用及推广。附图说明图1为阳性对照品检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测HER-2拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的蓝色荧光点即为HER-2阳性微滴，计算机自动换算成拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测内参基因人21-TFF3基因拷贝数，紫色直线为阈值线，20本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测HER‑2基因扩增的的核酸序列，其特征在于，包括如下引物对及探针：(1)扩增HER‑2基因扩增的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；(2)扩增HER‑2基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；(3)扩增21‑TFF3‑S基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示；(4)扩增21‑TFF3基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；(5)扩增21‑TFF3‑L基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示；其中，HER‑2探针SEQ ID NO：3序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，21‑TFF3基因探针SEQ ID NO：6序列的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，上述8条核酸序列在一次2孔检测中使用。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测HER-2基因扩增的的核酸序列，其特征在于，包括如下引物对及探针：(1)扩增HER-2基因扩增的引物序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示；(2)扩增HER-2基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；(3)扩增21-TFF3-S基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：4～5所示；(4)扩增21-TFF3基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；(5)扩增21-TFF3-L基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：7～8所示；其中，HER-2探针SEQIDNO：3序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，21-TFF3基因探针SEQIDNO：6序列的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，上述8条核酸序列在一次2孔检测中使用。2.一种用于检测HER-2基因扩增的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂：(1)2*supermix：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP等；(2)引物探针预混合液：将SEQIDNO：1～8所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，每条探针的浓度为10μM；1～3各核酸序列的母液以9:9:25的比例混合；4～6各核酸序列的母液以9:9:25的比例混合；6～8各核酸序列的母液以25:9:9的比例混合，最终形成引物/探针在反应体系中的浓度为900/250nM。(3)阳性对照：FISH检测为HER-2基因簇状扩增的福尔马林浸泡的石蜡组织样本(FFPE)；(4)阴性对照：FISH检测为HER-2基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：任绪义，虞闰六，宣文静，周磊，罗英，
申请(专利权)人：杭州迪安医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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