DNA探针‑菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法技术

本发明专利技术公开了一种DNA探针‑菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，包括：预处理、杂交、筛选，通过特定的正向引物与反向引物，经经聚合酶链式反应扩增合成了以地高辛标记的单链DNA探针，将待测试菌株的DNA与DNA探针进行杂交作用，通过显色测试杂交匹配结果筛选出产毒菌株。有益效果为：本发明专利技术方法可在8‑10小时内完成90个样品筛选，方法快速高效，特异性强，而且准确性高；本发明专利技术方法操作步骤简单，工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为生化试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，分析成本低廉，具有较高的市场前景与经济价值。

【技术实现步骤摘要】
DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法
本专利技术属于海洋生物
，尤其是涉及一种DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法。技术背景麻痹性贝类毒素（paralyticshellfishposoning，PSP）在已知赤潮毒素中毒性最强、分布最广、威胁性最大、引发毒害事件最频繁。其主要由石房蛤毒素（Saxitoxin，STX）及其衍生物组成，属于胍胺类毒素，是典型的钠离子通道阻断剂。目前已发现的PSP同系物多达58种。其生物合成基因为sxt基因簇。STX在赤潮检测、分子生物学、神经生物学、医学诊断、药物开发、军事生化武器战剂等研究中均有重要应用。在医学诊断与药物开发方面，STX独特的化学结构和毒理作用机制，成为研究细胞Na+通道的重要工具药。其具有抗肿瘤、抗病毒、镇痛、麻醉、解痉、降压、止喘等多种功效。其局部麻醉效果比普鲁卡因或可卡因强至少10万倍。目前，PSP的获得主要通过甲藻的规模化培养及产物提取制备而来。该方法周期长、成本高；且需要特殊的藻培养设备。与甲藻相比，细菌具有基因组小、易培养、遗传操作简单等特性，因此，利用产毒菌株发酵与产物分离制备PSP贝毒，是一条行之有效的替代方法。其关键是产毒菌株的快速筛选。其可通过微生物发酵、代谢产物提取、产物化学分析来完成。但工作量大、周期长，且化学分析所用毒素标准品价格昂贵、分析成本高。而目前尚无产麻痹性贝毒菌株的快速筛选技术。
技术实现思路
本方法的目的在于提供一种DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，所使用的探针具有与目标DNA特异性结合及杂交快速性，本专利技术的检测方法具有检测速度快、准确性高、灵敏度高的特性。本专利技术方法中所用的亚硫酸杆菌（Sulfitobactersp.）（CCTCCAB2016296）、赫夫勒氏菌（Hoefleasp.）（CCTCCAB2016294）均购买自中国典型培养物保藏中心；本专利技术方法中所用的大肠杆菌（Escherichiacoli）（ATCC25922）、宋氏志贺氏菌（Shigellasonnet）（ATCC29930）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）（ATCC6538）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）（ATCC23857）、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）（ATCC27853）、哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）（ATCCBB120）、杀鲑弧菌（Vibriosalmonicida）（ATCC43839）、腔隙莫拉氏菌（Moraxellalacunata）（ATCC17952）、类志贺邻单胞菌（Plesiomonasshigelloides）（ATCC14029）此九种菌株均购买自美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection)。为获得麻痹性贝毒产生细菌的特异性DNA探针，本专利技术用于扩增麻痹性贝类毒素的生物合成基因sxt基因的DNA探针的特异性引物为：正向引物17a，序列2：TAGTAGGAGTAGCACGCTGCA；反向引物17b，序列3：TCCTTCCTRGACCACGA。通过特定引物序列2和序列3所述的引物，经聚合酶链式反应（PCR）扩增合成了以地高辛标记的单链DNA探针，该DNA探针具有254个碱基，其序列为序列1：GATGTCTGGACTACGTCCCTCCTACTCGCGCTGTCGAACCTGAATATCGATCCGAGGACGCCGGCTGGGGCTTCGCCGACGCGGGCTCGGCGCGCATGGGCGGCACGTGACTCTCAACGCACGCTGAACGTCGGCAGGACCCTGCAGCACCAAGTCCAGCACCGCACGTTCGTGCAGCAGATCAGCGCCGTTTGAGGGCGAGTTCGCCTCGCATCGCGTCGTGGCAGACGGGATTAGGCAGATCTACAGAAGTC。为建立基于上述DNA探针的菌落原位杂交方法，本专利技术采用以下技术方案：DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，包括：预处理、杂交、筛选，具体包括以下步骤：预处理：制作10cm-12cm×10cm-12cm的硝酸纤维素膜，取待测试菌株单菌落点于硝酸纤维素膜，浸于0.50-0.52MNaOH溶液8-10分钟，取出自然干燥后夹在两张干滤纸之间，放置于真空烤箱中，78-80℃烘2-2.5小时；在TE缓冲液中加入溶菌酶，放入DNA膜，在36-37℃温度下作用30-32分钟后用TE缓冲液漂洗；将DNA膜置于10-12mL杂交缓冲液中，40-42℃温育1.5-2.0小时；预处理可以固定待测试菌株的DNA，并且除去细菌细胞残留物，方便后续的杂交操作；杂交：将以地高辛标记的DNA于沸水中煮10-15分钟变性，置冰浴中，取5.0-6.0mL标记DNA加入到2.5-3.0mL杂交缓冲液中，将膜由杂交缓冲液中取出置于塑料薄膜上，加入含地高辛标记DNA探针的杂交缓冲液中，40-42℃下作用2.0-2.5小时；将膜放至盛有2.0-3.0×SSC溶液的平皿内，洗涤2-3次，每次5-6分钟；筛选：将膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1-2分钟，弃去洗涤液；加入20-22mL1.0-1.2%的封闭液，室温放置60-70分钟，弃去溶液；加入20-25mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，36-37℃温育30-35分钟，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤3-4次，每次40-50mL；在显色缓冲液中平衡2-3分钟后，倾倒显色缓冲液，将膜置于塑料袋内；加入BCIP/NBT显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应，有斑点出现，即表示菌株产毒阳性；无斑点，即表示菌株产毒阴性；筛选方法迅速高效，特异性强，准确度高。作为优选，所用的TE缓冲液的pH为8.0。作为优选，所用的溶菌酶的用量为每毫升TE缓冲液加入4.8-5.2mg溶菌酶。作为优选，所用的杂交缓冲液为：5×SSC溶液，50-52mM磷酸缓冲液，1.0-1.1mMEDTA，10-12%硫酸葡聚糖，48-50%去离子甲酰胺，pH7.0-7.1。作为优选，所用的缓冲液为：0.10-0.11M顺丁烯二酸，0.14-0.15MNaCl，pH7.4-7.5。作为优选，所用的封闭液为：0.10-0.11MTris-HCl，0.15-0.16MNaCl，0.10-0.11MMgCl2，pH7.9-8.0。作为优选，所用的冲洗液为：0.10-0.11MTris-HCl，0.15-0.16MNaCl，pH7.4-7.5。作为优选，所用的显色缓冲液为：0.10-0.11MTris，0.10-0.11MNaCl，50-52mMMgCl2，pH9.3-9.5。作为优选，所用的显色液为：0.30-0.32mg/mLNBT，0.15-0.16mg/mLBCIP，pH9.0-9.1。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1）通过菌落原位斑点分子杂交，DNA探针可特异性检测待测菌株DNA样品中有否有麻痹性贝毒合成sxtA基因核酸的存在，可在8-10小时内完成90个样品筛选，本专利技术方法快速高效，特异性强，而且准确性高；2）本专利技术方法操作步骤简单，工作量小本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA探针‑菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于，所述的DNA探针为经地高辛标记含有254个碱基序列1所述的单链DNA探针，所述的序列1为：GATGTCTGGACTACGTCCCTCCTACTCGCGCTGTCGAACCTGAATATCGATCCGAGGACGCCGGCTGGGGCTTCGCCGACGCGGGCTCGGCGCGCATGGGCGGCACGTGACTCTCAACGCACGCTGAACGTCGGCAGGACCCTGCAGCACCAAGTCCAGCACCGCACGTTCGTGCAGCAGATCAGCGCCGTTTGAGGGCGAGTTCGCCTCGCATCGCGTCGTGGCAGACGGGATTAGGCAGATCTACAGAAGTC。

【技术特征摘要】
1.DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于，所述的DNA探针为经地高辛标记含有254个碱基序列1所述的单链DNA探针，所述的序列1为：GATGTCTGGACTACGTCCCTCCTACTCGCGCTGTCGAACCTGAATATCGATCCGAGGACGCCGGCTGGGGCTTCGCCGACGCGGGCTCGGCGCGCATGGGCGGCACGTGACTCTCAACGCACGCTGAACGTCGGCAGGACCCTGCAGCACCAAGTCCAGCACCGCACGTTCGTGCAGCAGATCAGCGCCGTTTGAGGGCGAGTTCGCCTCGCATCGCGTCGTGGCAGACGGGATTAGGCAGATCTACAGAAGTC。2.根据权利要求1所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的DNA探针为通过特定的正向引物17a与反向引物17b，经聚合酶链式反应（PCR）扩增合成了以地高辛标记的单链DNA探针。3.根据权利要求2所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的正向引物17a，序列为：TAGTAGGAGTAGCACGCTGCA；所述的反向引物17b，序列为：TCCTTCCTRGACCACGA。4.根据权利要求1所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的方法包括：1）预处理：制作并固定待测试菌株的DNA；2）杂交：将待测试菌株的DNA与DNA探针进行杂交作用；3）筛选：通过显色测试杂交匹配结果。5.根据权利要求4所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的预处理步骤为：制作10cm-12cm×10cm-12cm的硝酸纤维素膜，取待测试菌株单菌落点于硝酸纤维素膜，浸于0.50-0.52MNaOH溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓玲，杨桥，穆军，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33