一种端粒探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种端粒探针及其制备方法和应用，该端粒探针为在CdSSe/ZnS量子点表面偶联了单链DNA，该端粒探针可以通过原位杂交技术结合到细胞端粒，用单分子定位技术对杂交了端粒探针的端粒进行成像，实现对端粒的检测。本发明专利技术实现了端粒的特异性标记，利用单分子定位显微镜成像，分辨率更高，克服了荧光显微技术的受光学衍射极限限制的缺点，利用本发明专利技术可以实现对端粒结构的进一步研究。

【技术实现步骤摘要】
一种端粒探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及DNA探针及其制备方法和应用，特别涉及一种端粒探针及其制备方法和应用。
技术介绍
端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，其序列中是富含G核苷酸的串联重复序列。染色体DNA末端膨大成粒状，像帽子那样盖在每条染色单体的两端，因此，每对染色体有2个染色单体和4个端粒。该结构和染色体断裂形成的末端存在许多差异，如不能相互融合，而且只有当染色体末端结构完整时，细胞才能复制。在脊椎动物中端粒序列是由TTAGGG重复序列及其互补序列构成的双链结构，并且其中一条单链的3’悬突于外，构成了一种由数百个碱基组成的悬突结构。这个悬突结构再通过折叠作用与双链形成一个环状结构(T环，t-loop)，对染色体末端起到保护作用。在DNA复制过程中，染色体末端有一端遗传信息得不到复制，所以在普通人体细胞中，端粒的末端会随周期性复制而逐渐缩短，这就限制了细胞的增殖能力，当至某一特定界限时，细胞将停止分裂而凋亡。端粒不仅被认为是与细胞衰老有关，而且还与许多疾病有关。所以端粒的研究在癌症治疗领域意义重大。目前已存在了一些研究端粒的常用方法：DNA印迹法、杂交保护分析法(HPA)、定量PCR法(PCR)、单个端粒长度分析法(STELA)，但这些方法都存在着各种问题，例如不能在细胞水平给出详细的端粒信息，不均匀的引物退火可能导致端粒长度测量不充分以及引物自身之间可能发生杂交等问题。而荧光原位杂交技术(FISH)利用端粒特异性，直接将探针标记在端粒序列上，结合荧光显微镜技术，不仅操作简单，而且尺寸小的端粒探针增加了进入细胞的渗入度。通常，FISH技术使用的荧光显微技术，其成像分辨率受光学衍射极限限制，一般只能达到200-300nm。这一分辨率使得人们无法对端粒进行细致地观察。光学超分辨成像突破了衍射极限限制，达到更高的空间分辨率。现在用于超分辨成像的技术主要包括3类：基于光调制的受激发射损耗(STED)技术和结构光照明显微镜(SIM)技术以及基于单分子定位的光激活定位显微镜(SMLM)和随机光学重构显微镜(STORM)。相比于STED和SIM技术，单分子定位显微镜(SMLM)的成像分辨率更高，这使得单分子定位技术在生物医学领域得到广泛运用。因此，利用单分子定位技术进行端粒成像，有望对端粒的结构进行深入地研究。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术为了克服端粒检测中遇到的检测步骤复杂且检测不准确的问题，提供了这一种端粒探针，实现端粒的精准检测。本专利技术还提供了该端粒探针的制备方法及其应用。技术方案：本专利技术所述一种端粒探针，为在CdSSe/ZnS量子点表面偶联了单链DNA；所述单链DNA通过5’端的氨基与CdSSe/ZnS量子点表面的羧基配体偶联；所述单链DNA序列为3’-AATCCCAATCCCAATCCCTTTTT-(NH2)6-5’。上述的端粒探针的制备方法，包含以下步骤：(1)油相量子点转相：将油相CdSSe/ZnS量子点溶于三氯甲烷中，加入巯基丙酸，混合均匀后再加入四甲基氢氧化铵调节溶液pH值，搅拌反应；反应结束后，向溶液中加入水，搅拌，静置分层，取上清液；在上清液中加入无水乙醇沉淀，离心，去除上清液，所得沉淀为水相CdSSe/ZnS量子点；将油相CdSSe/ZnS量子点转化为水相CdSSe/ZnS量子点，原因是使CdSSe/ZnS量子点符合单分子定位技术对荧光探针的要求，即量子点在水溶液或者磷酸盐缓冲液中具有单波长激发下的荧光闪烁行为。(2)端粒探针的合成：将步骤(1)中所得的水相CdSSe/ZnS量子点溶于水溶液，加入NHS和EDC溶液，再加入DNA单链，反应得端粒探针。同时水溶液也可以替换为PBS溶液。NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用于活化羧基。步骤(1)中，所述油相CdSSe/ZnS量子点与巯基丙酸质量体积比为25:1-5mg/mL。步骤(1)中，用四甲基氢氧化铵调节溶液pH值，使得反应溶液的pH值≥11。步骤(2)中，所述水相CdSSe/ZnS量子点、NHS与EDC的质量摩尔比为100-300:1:1g/mol/mol。步骤(2)中，所述水相CdSSe/ZnS量子点与单链DNA的质量摩尔比为50-150:1g/mol。上述油相量子点在进行后续合成时，需进行前期处理，将油相量子点先溶于无水乙醇中，摇晃均匀，然后离心沉淀，将所得沉淀进行后续的试验。本专利技术中油相CdSSe/ZnS量子点转化为水相CdSSe/ZnS量子点，可以控制反应物的用量实现完全转化。上述端粒探针在端粒检测中的应用。方法为：(1)将细胞固定，加入TritonX-100，随后用PBS溶液清洗；(2)向经过步骤(1)处理后的细胞中加入RNA酶酶解，随后加入胃蛋白酶酶解；(3)将经过步骤(2)处理的细胞用乙醇脱水，加热，加入端粒探针进行杂交；(4)将经步骤(3)中处理的细胞进行超分辨显微成像，检测端粒。上述端粒探针用于检测端粒是基于荧光原位杂交技术的端粒超分辨成像的方法，具体方法为：细胞接种于八孔板内并孵育24h，之后弃去培养液，加入4％的多聚甲醛(4％多聚甲醛溶液中含0.1％戊二醛)固定细胞20min后，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4，10mmol/L)清洗2次；加入100-200μL1％TritonX-100或2％的TritonX-100溶液，轻微摇晃细胞30min以增加细胞的通透性，用PBS溶液清洗2次；加入100-200μL100μg/mL-200μg/mL的RNA酶后置于37℃恒温箱反应20-30min，PBS溶液清洗2次；加入100-200μL0.005-0.01％的胃蛋白酶溶液置于37℃恒温箱反应10-20min，PBS溶液清洗2次；用70％乙醇，85％乙醇和纯无水乙醇进行梯度脱水；将该八孔板置于85℃的烘箱中加热5-10min使细胞DNA变性；加入100-150μL0.1-0.3μg/mL的端粒探针溶液，85℃反应10-20min后，移至37℃的恒温箱过夜杂交，此过程中应将八孔板密封以防止溶液蒸发；弃去多余的探针溶液后，将该八孔板置于55-60℃的恒温水浴摇床中，用含0.1％Tween20的PBS溶液轻轻清洗2次，每次清洗持续时间10-20min；最后，弃去清洗溶液，加入PBS溶液或者去离子水后，进行超分辨显微镜成像。本专利技术利用荧光原位杂交(FISH)技术，端粒探针使用CdSSe/ZnS量子点作为荧光团，将端粒探针杂交至细胞内端粒上，实现端粒的荧光标记；利用单分子定位技术对杂交了探针的端粒进行超分辨定位与成像，单分子定位技术的空间分辨率可达50nm，从而实现突破光学衍射极限(200-300nm)的超分辨率成像。本专利技术所述的单分子定位超分辨光学成像技术为SMLM(即singlemoleculelocalizationmicroscopy)技术。除非另有说明，本专利技术中所述“％”为质量百分浓度。有益效果：本专利技术采用在水相中具有荧光闪烁效应的CdSSe/ZnS量子点作为端粒探针的荧光基团，符合单分子定位技术的应用要求，探针量子产率高、开关次数多、光稳定性好，提高了单分子定位成像的分辨率；本专利技术的端粒探针对端粒进行超分辨成像，分辨率可达50nm，可实现对端粒细致本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种端粒探针，其特征在于，所述端粒探针为在CdSSe/ZnS量子点表面偶联了单链DNA；所述单链DNA通过5’端的氨基与CdSSe/ZnS量子点表面的羧基配体偶联；所述单链DNA序列为3’‑AATCCCAATCCCAATCCCTTTTT‑(NH2)6‑5’。

【技术特征摘要】
1.一种端粒探针，其特征在于，所述端粒探针为在CdSSe/ZnS量子点表面偶联了单链DNA；所述单链DNA通过5’端的氨基与CdSSe/ZnS量子点表面的羧基配体偶联；所述单链DNA序列为3’-AATCCCAATCCCAATCCCTTTTT-(NH2)6-5’。2.一种制备权利要求1所述的端粒探针的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)油相量子点转相：将油相CdSSe/ZnS量子点溶于三氯甲烷中，加入巯基丙酸，然后用四甲基氢氧化铵调节溶液pH值，搅拌反应；反应结束后，向溶液中加入水，搅拌，静置分层，取上清液；在上清液中加入无水乙醇，沉淀，离心，去除上清液，所得沉淀为水相CdSSe/ZnS量子点；(2)端粒探针的合成：将步骤(1)中所得的水相CdSSe/ZnS量子点溶于水溶液，加入NHS和EDC，搅拌，再加入DNA单链，反应得端粒探针。3.根据权利要求2所述的端粒探针的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述油相CdSSe/ZnS量子点与巯基...

【专利技术属性】
技术研发人员：宗慎飞，王乐，陈晨，王著元，崔一平，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32