利用染色体原位荧光杂交检验CHO外源基因插入位点的方法技术

本发明专利技术公开一种利用染色体原位荧光杂交检验CHO外源基因插入位点的方法，包括步骤：1)探针制备：通过切口平移的方法处理构建有插入基因片段的载体，获得带有荧光基团的DNA探针；2)染色体铺展：将CHO细胞加入秋水仙胺后进行固定及涂片；3)探针杂交：将步骤1)中制备的DNA探针和步骤2)经过处理的样品涂片进行杂交；4)显微镜观察荧光的分布。本发明专利技术结合了细胞学和染色体组学，通过荧光蛋白标记的探针，可以在荧光显微镜下直观地看到插入位点分布在哪一(几)条染色体的什么位置，从而对细胞株的单克隆性进行判断。通过FISH技术可以在一个星期内完成对细胞系单克隆性的检测，并且通量也比插入序列分析有了大幅提高。

【技术实现步骤摘要】
利用染色体原位荧光杂交检验CHO外源基因插入位点的方法
本专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及采用CHO(ChineseHamsterOvary，中国仓鼠卵巢细胞)细胞表达蛋白的领域。
技术介绍
细胞株的单克隆性是指该细胞株的所有细胞追本溯源都来源于同一个母细胞。在生物制药领域，表达蛋白的CHO(ChineseHamsterOvary，中国仓鼠卵巢细胞)细胞株的单克隆性对蛋白产物的质量有极大的影响。非单克隆的细胞株蛋白产物的纯度，以及在工业生产工艺调整过程中的稳定性都要低于单克隆细胞株。世界范围内的医药审查部门，包括美国FDA，中国CFDA，欧洲EMA，以及WTO都对申请药品的单克隆性做了严格的要求。业界对于细胞株单克隆性的检验方法主要有：插入位点序列分析和Southern印记杂交。插入位点序列分析通过PCR以及测序确定外源片段在宿主细胞基因组中的插入位点，并通过比较亚克隆(或细胞与细胞)之间插入位点来确认细胞株的单克隆性。Southern印记杂交则是通过比较基因组酶切片段的长度来证明单克隆性。相比较而言，插入位点序列分析虽然能够精确定位外源基因的插入位点，但是耗时较长通量较低；而Southern印记分析容易受实验中各种随机因素的影响，重复性比较差，而且精度较低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种检验CHO外源基因插入位点的方法，能减少细胞系单克隆性检测的时间和/或提高检测通量的。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种利用染色体原位荧光杂交检验CHO外源基因插入位点的方法，包括以下步骤：1)探针制备；2)染色体铺展；3)探针杂交；4)显微镜观察荧光的分布。具体的，所述步骤1)，通过切口平移的方法处理构建有插入基因片段的载体，获得长度较为一致并带有荧光基团的DNA探针。较佳的，所述步骤1)，使用荧光探针制备试剂盒。较佳的，所述步骤1)，先对探针DNA进行切口平移反应，将探针切成短的氨基化片段再进行荧光染料的染色。较佳的，所述步骤1)，插入基因片段可以为任何在CHO细胞系中进行外源蛋白表达的外源基因。较佳的，所述步骤1)，荧光基团可以为任何可以在荧光显微镜下显示可见强烈荧光的分子，包括但不限于各种绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白，黄色荧光蛋白等等。具体的，所述步骤2)，将CHO细胞加入秋水仙胺后进行固定及涂片。较佳的，所述步骤2)，CHO细胞充分传代恢复之后再进行铺展操作。细胞从冻存状态复苏后需经过充分传代才可以进行下一步的固定操作。较佳的，所述步骤2)，CHO细胞在固定的24小时前，加入秋水仙胺以抑制细胞分裂将细胞固定在分裂中期。较佳的，所述步骤2)，固定细胞所用的固定液为Carnoy’s固定液(卡诺氏固定液，由甲醇和乙酸体积比3:1混合)。较佳的，所述步骤2)，CHO细胞涂片于玻片上之后通过熏蒸使得细胞破裂染色体散开，平铺于载玻片上。较佳的，所述步骤2)，CHO细胞涂片完成后要经过RNA酶以及胃蛋白酶的处理，消化染色体中的组蛋白，暴露细胞的基因组DNA。具体的，所述步骤3)，将步骤1)中制备的DNA探针和步骤2)经过处理的样品涂片进行杂交。较佳的，所述步骤3)，探针和染色体在充满甲酰胺蒸汽的环境中杂交过夜。较佳的，所述步骤3)，在杂交前CHO细胞基因组DNA以及探针DNA均需要通过高温变性使得DNA双链解开。较佳的，所述步骤3)，变性后于37℃杂交过夜。较佳的，上述步骤4)，荧光显微镜用100倍油镜观察。本专利技术利用FISH技术能够高效快速地确认外源片段在染色体中的插入位点，通过荧光蛋白标记的探针，可以在荧光显微镜下直观地看到插入位点分布在哪一(几)条染色体的什么位置，并且通过比较亚克隆(或细胞之间)插入位点的异同判断细胞株的单克隆性。和插入位点序列分析技术相比较而言，本专利技术具有周期短通量高等优点；和Southern印记杂交相比，本专利技术还具有更好的稳定性以及可重复性。在工业生产中，快速准确地判断外源基因插入位点以及细胞株单克隆性可以避免下游放大生产的过程中由于细胞株的非单克隆性而造成的不必要的损失。附图说明图1～图2为本专利技术具体实施方式中RCB实验的两个代表性照片。图3为本专利技术具体实施例中该细胞株的一个亚克隆也被用于了相同的FISH实验的一个代表性照片。附图标记说明：1所示方框内亮白色斑点部分为荧光探针在荧光显微镜下产生的信号，即外源基因片段的插入位点；2所示灰色条带部分为分散的细胞染色体。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。待检测样品可以为任何一个已构建细胞株的RCB(Researchcellbank)。1.探针制备步骤1、选择带有插入片段基因的载体质粒，测定其浓度，根据质粒浓度选择0.5-2g质粒DNA进行切口平移反应。将反应试剂按照下表进行混合。步骤2、将配置好的切口平移反应溶液于15℃孵育两个小时。步骤3、将反应溶液中的DNA通过DNA亲和纯化柱进行纯化，并通过乙醇沉淀的方法将DNA离心重悬于纯水中。步骤4、将重悬的DNA于96℃变性5-10分钟，再置于冰上。步骤5、将溶解于DMSO的荧光染料加入到DNA溶液中，充分振荡后离心收集管壁上所有的溶液。于暗处室温避光反应一小时。步骤6、再次通过DNA纯化柱纯化溶液中已经被荧光染料标记的DNA，并通过乙醇沉淀的方法将DNA重新溶解于纯水中。至此探针制备完成。2.染色体铺展步骤1、将RCB细胞复苏传代，待细胞完全恢复后加入1％体积比的秋水仙胺以抑制微管的形成将细胞周期固定在分裂中期。步骤2、加入秋水仙胺24小时之后，对细胞进行固定。固定液为Carnoy’sFixative(卡诺氏固定液，由甲醇：乙酸体积比3:1混合)。步骤3、将固定好的细胞涂片于载玻片上，待样品略微干透后，再滴上2-3滴乙酸，并在水蒸气环境下熏蒸。熏蒸完毕后在室温干燥，完全干燥后即可进行探针杂交。3.探针杂交步骤1、根据玻片的数量计算需配置的杂交液和探针的量。配置比例见下表。步骤2、将配置完成后的杂交液置于70℃水浴锅变性10分钟，然后立即置于冰上。步骤3、将完成染色体铺展的玻片用RNase酶处理消化样品中的残留RNA。用2XSSC缓冲液清洗玻片。步骤5、用胃蛋白酶处理玻片以消化样品染色体中的组蛋白，暴露其基因组DNA。用去离子水和2XSSC缓冲液清洗玻片。步骤6、用4％多聚甲醛固定样品，用2XSSC缓冲液清洗玻片。然后通过梯度浓度的乙醇使样品脱水。步骤7、加入步骤2中处理好的探针，于70℃变性5分钟之后，在37℃于充满甲酰胺蒸汽的环境中过夜杂交。步骤8、杂交完成后分别用2XSSC，0.1XSSC和纯水清洗玻片。清洗完成后在室温风干，加入带有DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)的封片液对染色体进行负染色，盖上盖玻片并封片保存。4.荧光显微镜观察得到的封片完成的玻片于荧光显微镜下观察并拍照。实验结果如图1及图2所示，利用本申请中描述的FISH技术，可以1)将细胞的染色体均匀的分布于玻片上，并且最大范围内的避免染色体之间的互相纠缠重叠；2)根据染色体的大小和形态清晰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用染色体原位荧光杂交检验CHO外源基因插入位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)探针制备：通过切口平移的方法处理构建有插入基因片段的载体，获得带有荧光基团的DNA探针；2)染色体铺展：将CHO细胞加入秋水仙胺后进行固定及涂片；3)探针杂交：将步骤1)中制备的DNA探针和步骤2)经过处理的样品涂片进行杂交；4)显微镜观察荧光的分布。

【技术特征摘要】
1.一种利用染色体原位荧光杂交检验CHO外源基因插入位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)探针制备：通过切口平移的方法处理构建有插入基因片段的载体，获得带有荧光基团的DNA探针；2)染色体铺展：将CHO细胞加入秋水仙胺后进行固定及涂片；3)探针杂交：将步骤1)中制备的DNA探针和步骤2)经过处理的样品涂片进行杂交；4)显微镜观察荧光的分布。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)，先对探针DNA进行氨基化再进行荧光染料的染色。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)，插入基因片段可以为任何在CHO细胞系中进行外源蛋白表达的外源基因。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)，荧光基团可以为任何可以在荧光显微镜下显示可见强烈荧光的分子，包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)，CHO细胞充分传代恢复之后再进行铺展操作。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)，...

【专利技术属性】
技术研发人员：章雨，李爱群，高侨，张丽，蔡洁行，周伟昌，陈智胜，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，无锡药明康德生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31