一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组、试剂盒及应用。探针组包括Aml、(ACT)6、(GAA)6、(TTG)6四种探针，其中Aml的碱基序列为：5′‑GATCCATGTGTGGTTTGTGGAAAGAACAC ACATGCAATGACT CTAGTGGTT‑3′；(ACT)6的碱基序列为：5′‑ACTACTACTACTACTACT‑3′；(GAA)6的碱基序列为：5′‑GAAGAAGAAGAAGAAGAA‑3′；(TTG)6的碱基序列为：5′‑TTGTTGTTGTTGTTGTTG‑3′。该探针组为识别燕麦属植物染色体的18‑51bp寡序列探针，有助于建立稳定便捷的荧光原位杂交反应体系。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组、试剂盒及应用
本专利技术属于荧光原位杂交探针的应用领域，具体涉及一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组、试剂盒及应用。
技术介绍
现有检测燕麦属植物染色体的方法有C带，GISH，FISH，等。C带能使异染色质着色，这种异染色质通常位于着丝粒周围并常含有高度重复序列的DNA，此方法观察到的图片为黑白图片，信号位置局限在着丝粒周围。GISH，即基因组原位杂交技术，是以总基因组序列为探针标记染色体，探针准备要求大量高浓度基因组DNA，局限在于基因组染色体亲缘关系近时不能被区别，另外封阻比例将影响杂交信号强弱，片子回收利用难度大，实验重复性不强，图片为彩色。FISH，即荧光原位杂交技术，多以几百碱基DNA片段为探针，探针浓度要求较低，使用量少，可以识别GISH不能识别的近缘基因组染色体，无需封阻，片子回收再利用容易，便于对同一片子进行多次杂交实验，图片为多色。本专利技术通过设计、合成用于检测燕麦属植物染色体的18-51bp的寡序列探针，建立稳定便捷的荧光原位杂交反应体系，克服了现有燕麦属植物染色体检测的诸多问题，为燕麦属植物染色体的检测提供新方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组、试剂盒及应用。本专利技术的技术方案为：第一个方面，本专利技术提供一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，包括Aml、(ACT)6、(GAA)6、(TTG)6四种探针，其中所述Aml探针由51个碱基对组成，其碱基序列为：5′-GATCCATGTGTGGTTTGTGGAAAGAACACACATGCAATGACTCTAGTGGTT-3′，用于特异性识别燕麦属C基因组所有染色体；所述(ACT)6探针的碱基序列为：5′-ACTACTACTACTACTACT-3′，用于识别偏好C基因组部分染色体的部分结构，也微弱识别A染色体组部分染色体的部分结构；所述(GAA)6探针的碱基序列为：5′-GAAGAAGAAGAAGAAGAA-3′，用于识别偏好A和C基因组部分染色体的部分结构；所述(TTG)6探针的碱基序列为：5′-TTGTTGTTGTTGTTGTTG-3′，用于识别偏好A基因组部分染色体部分结构，微弱识别C基因组部分染色体的部分结构。进一步地，所述Aml探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。进一步地，所述(ACT)6探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。进一步地，所述(GAA)6探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。进一步地，所述(TTG)6探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。第二个方面，本专利技术提供一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，包括：(1)上述探针组；(2)酶解液；(3)4％多聚甲醛液；(4)2×SSC缓冲液；(5)70％FA液；(6)杂交液。进一步地，所述酶解液的配制方法为：每1mL的柠檬酸缓冲液中加入0.04g纤维素酶和0.02g果胶酶；其中柠檬酸缓冲液的配制方法为：每50mL的ddH2O加0.5707g柠檬酸三钠和0.4324g柠檬酸。进一步地，所述4％多聚甲醛液的配制方法为：每100mL的1×PBS缓冲液加入4g多聚甲醛，在60℃水浴锅中水浴2-3h，其中所述1×PBS缓冲液的配制方法为：每1000mL的ddH2O加入8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.42g磷酸氢二钠和0.27g磷酸二氢钾。进一步地，所述2×SSC缓冲液的配制方法为：每1000mL的ddH2O加入8.823g柠檬酸三钠和17.532g氯化钠。进一步地，所述70％FA液由去离子甲酰胺(FA)和2×SSC缓冲液按照体积比7:3组成。进一步地，所述杂交液由等体积的1×TE和2×SSC缓冲液组成；其中1×TE的配制方法为：每800mL的ddH2O中加入1.211gTris和0.372gEDTANa2·2H2O，用HCl调pH到8.0，定容到1000mL，灭菌后即得。第三个方面，本专利技术提供一种用于检测燕麦属植物染色体的方法，是采用上述试剂盒，包括以下步骤：1)燕麦属植物染色体载玻片标本的制备：将燕麦属植物种子用双蒸水浸泡，置于4℃环境中放置24h，吸去多余水分，并于22℃恒温培养，待根尖长至1.5～2.0cm时，剪取1～1.5cm根尖组织，依次用N2O处理5h、冰醋酸处理5min，然后置于75％酒精中于-20℃保存；将低温保存的根尖组织以双蒸水清洗后切取根尖分生组织1～2mm，置于酶解液中于37℃酶解45min，去除酶解液，依次用双蒸水、75％酒精、95％酒精、100％酒精清洗根尖分生组织后室温晾干；在根尖组织中加入冰醋酸制成悬浮液；将悬浮液滴于载玻片上室温晾干后镜检，镜检良好的玻片于-20℃保存；2)荧光原位杂交：将载玻片置于4％多聚甲醛中处理10min，然后用2×SSC缓冲液处理两次，每次5min，再依次用75％酒精、95％酒精、100％酒精梯度处理，每次5min，室温晾干后滴加70％FA液，盖上盖玻片，于80℃变性2min；载玻片变性完成后于5s内依次放入-20℃的75％酒精、95％酒精、100％酒精梯度处理，每次5min，室温晾干；在晾干的载玻片上滴加放有探针的杂交液，每张载玻片滴加10μL放有探针的杂交液，其中每种探针含有0.5μL，剩余为杂交液；盖上盖玻片，于黑暗条件下在杂交盒中于37℃恒温孵化1.5～2h；将孵化完成的载玻片在避光条件下依次用2×SSC缓冲液清洗3min、双蒸水清洗2min，室温晾干；3)信号检测：晾干后的载玻片上加入DAPI，盖上盖玻片，采用荧光显微镜对载玻片进行检测，采集检测图像；4)载玻片回收：信号采集之后回收制片并放入2×SSC缓冲液中于60℃水浴5min，依次在75％酒精、95％酒精、100％酒精中梯度处理，每次5min，处理完成后将回收制片于日光灯下放置12h；-20℃保存以备下次使用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术基于荧光原位杂交技术，提供了一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，该探针组为识别燕麦属植物染色体的18-51bp的寡序列探针，有助于建立稳定便捷的染色体荧光原位杂交反应体系；本专利技术还提供了一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，该试剂盒应用于检测燕麦属植物染色体，具有重复性好，操作简便的优点；其中杂交液的组成比前人报道的简单了很多，只包含两种极易配制的液体。本专利技术还提供了一种用于检测燕麦属植物染色体的方法，该方法可反复使用制片，并且探针准备容易、快速，灵敏度高，需求探针DNA量少，价廉物美，根尖制片容易，易于获取中期染色体，对避光要求相对较低，整个实验流程的时间缩短，操作简便。附图说明图1为本专利技术的(ACT)6探针标记的燕麦属二倍体植物(AA基因组)的信号位点分布图像，其中图a～f分别表示Avenawiestii，Avenalongiglumis，Avenabrevis，Avenanuda，Avenastrigosa，Avenacanariensis的信号位点分布图像；(ACT)6探针采用FAM标记5’端，显示杂交信号如图中箭头所示绿色信号，标尺为5μm；图2为本专利技术的(ACT)6探针标记的燕麦属四倍体植物(AABB基因组)的信号位点分布图像，其中图a～c分别表示Avenabarbata，Avenaab本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，包括Aml、(ACT)6、(GAA)6、(TTG)6四种探针，其中所述Aml探针由51个碱基对组成，其碱基序列为：5′‑GATCCATGTGTGGTTTGTGGAAAGAACACACATGCAATGACTCTAGTGGTT‑3′，用于特异性识别燕麦属C基因组所有染色体；所述(ACT)6探针的碱基序列为：5′‑ACTACTACTACTACTACT‑3′，用于识别偏好C基因组部分染色体的部分结构，也微弱识别A染色体组部分染色体的部分结构；所述(GAA)6探针的碱基序列为：5′‑GAAGAAGAAGAAGAAGAA‑3′，用于识别偏好A和C基因组部分染色体的部分结构；所述(TTG)6探针的碱基序列为：5′‑TTGTTGTTGTTGTTGTTG‑3′，用于识别偏好A基因组部分染色体部分结构，微弱识别C基因组部分染色体的部分结构。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，包括Aml、(ACT)6、(GAA)6、(TTG)6四种探针，其中所述Aml探针由51个碱基对组成，其碱基序列为：5′-GATCCATGTGTGGTTTGTGGAAAGAACACACATGCAATGACTCTAGTGGTT-3′，用于特异性识别燕麦属C基因组所有染色体；所述(ACT)6探针的碱基序列为：5′-ACTACTACTACTACTACT-3′，用于识别偏好C基因组部分染色体的部分结构，也微弱识别A染色体组部分染色体的部分结构；所述(GAA)6探针的碱基序列为：5′-GAAGAAGAAGAAGAAGAA-3′，用于识别偏好A和C基因组部分染色体的部分结构；所述(TTG)6探针的碱基序列为：5′-TTGTTGTTGTTGTTGTTG-3′，用于识别偏好A基因组部分染色体部分结构，微弱识别C基因组部分染色体的部分结构。2.根据权利要求1所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，所述Aml探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。。3.根据权利要求1所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，所述(ACT)6探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。4.根据权利要求1所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，所述(GAA)6探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。5.根据权利要求1所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，所述(TTG)6探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。6.一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，其特征在于，包括：(1)上述探针组；(2)酶解液；(3)4％多聚甲醛液；(4)2×SSC缓冲液；(5)70％FA液；(6)杂交液；所述杂交液的由等体积的1×TE和2×SSC缓冲液组成；其中1×TE的配制方法为：每800mL的ddH2O中加入1.211gTris和0.372gEDTANa2·2H2O，用HCl调pH到8.0，定容到1000mL，灭菌后即得。7.根据权利要求6所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，其特征在于，所述酶解液的配制方法为：每1mL的柠檬酸缓冲液中加入0.04g纤维素酶和0.02g果胶酶；其中柠檬酸缓冲液的配制方法为：每50mL的ddH2O加0.5707g柠檬酸三钠和0...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗小梅，周永红，陈亮，万文林，刘俊成，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51