本发明专利技术提供一种小鼠Shank 3基因cRNA探针及原位杂交显色方法：该cRNA探针包括与小鼠Shank 3基因mRNA参考序列NM_021423.3的3465‑4108位互补的核苷酸序列。将小鼠脑组织标本置于杂交液中；杂交完成后漂洗、封闭，与抗体结合；然后利用TSA‑biotin放大处理后进行荧光显色。本发明专利技术提出的cRNA探针针对Shank 3基因的特异性高，在不同个体的脑组织中均可以高效完成Shank 3基因的识别，可确保小鼠Shank 3基因原位杂交显色的特异性和高效性，显色效果更好，可与其他杂交或免疫荧光染色结合使用。
【技术实现步骤摘要】
小鼠Shank3基因cRNA探针及原位杂交显色方法
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种Shank3基因cRNA探针及其荧光原位杂交显色方法。
技术介绍
Shank家族是一类新发现的支架蛋白，其可通过不同的结构域与细胞内多种蛋白相互作用，发挥多种作用。研究表明其中的Shank3基因与自闭症的发病密切相关，Shank3基因的突变可导致自闭症样行为的出现。蛋白相互作用等研究表明Shank3蛋白可能通过不同结构域与胞内多种蛋白相互作用，最终影响细胞骨架和突触的结构与功能等。但关于这方面的形态学证据明显不足，主要受限于目前商品化的抗体均不能清晰显示Shank3蛋白的细胞内定位。基于cRNA探针的原位杂交显色方法在基因功能研究领域得到一定的应用，例如中国专利CN102559904A、CN106916886A。但是，筛选针对Shank家族，特别是Shank3基因的兼具杂交特异性和显色灵敏性的cRNA探针还是领域内的难题。尽管利用具有放大显色效果功能的试剂进行处理，更利于显色，但是，目前尚未见到适合于Shank家族，特别是Shank3的cRNA探针原位杂交显色用放大体系，这也是导致相应的cRNA探针一直未能获得的一个重要原因。此外，现有基于cRNA探针的显色方法存在显色试剂(例如放大用试剂，杂交液)组成复杂等不足之处，同时，显色效果仍有待提高。目前尚未见到针对Shank3基因的cRNA探针及荧光原位杂交显色方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种小鼠Shank3基因cRNA探针及原位杂交显色方法。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种小鼠Shank3基因cRNA探针，该cRNA探针包括与小鼠Shank3基因mRNA参考序列NM_021423.3的3465-4108位互补的核苷酸序列，或者包括该核苷酸序列的同源序列。优选的，所述cRNA探针的序列如SEQ.ID.NO.3所示(尽管实际探针为该序列中T替换为U后的RNA序列，但是本领域通常以对应的U替换为T后的DNA形式表示cRNA，包括mRNA的参考序列也是如此)。优选的，所述同源序列是以小鼠脑组织cDNA为模板，并使用以下引物扩增得到的：上游引物：5’-ACCCGAGACTCTGAGAGAGG-3’；下游引物：5’-AATGGTGCTTGTGGTCTCCA-3’。优选的，所述cRNA探针上标记有地高辛。一种小鼠Shank3基因原位杂交显色方法，包括以下步骤：1)制备用于原位杂交的小鼠脑组织标本(例如冰冻切片)；2)将小鼠脑组织标本依次经过杂交前处理、杂交预处理后置于杂交液中进行原位杂交；所述原位杂交中采用的杂交液由杂交预处理中使用的预杂交液和小鼠Shank3基因cRNA探针组成，所述cRNA探针包括与小鼠Shank3基因mRNA参考序列NM_021423.3的3465-4108位互补的核苷酸序列，或者包括该核苷酸序列的同源序列；该cRNA探针上标记有地高辛；3)杂交完成后依次进行漂洗、封闭，然后利用针对地高辛的抗体对结合在小鼠脑组织标本上的cRNA探针进行识别；然后利用TSA-biotin对结合在小鼠脑组织标本上的cRNA探针进行放大处理，然后进行荧光显色；TSA-biotin由0.05gBSA、5μLtyramide-biotin、15μL的1.0mg/mL葡萄糖氧化酶、50μL的200mg/mLβ-D-葡萄糖以及5mL0.1MPB组成；放大处理的条件为：经TNT以及0.1MPB漂洗后，于TSA-biotin中避光孵育20-40分钟。优选的，所述杂交前处理中，将小鼠脑组织标本依次置于以下液体中进行处理：含体积分数1-3％H2O2的0.1MDEPC-PB中避光孵育10-20分钟；0.1MDEPC-PB中漂洗10-20分钟；含体积分数0.3％TritonX-100的0.1MDEPC-PB中孵育20-30分钟；含体积分数0.25％乙酸酐的0.1M三乙醇胺中孵育10-20分钟；0.1MDEPC-PB中漂洗1-3次，每次10-20分钟。优选的，所述杂交预处理的条件为：于预杂交液中55-60℃孵育1-2小时；所述预杂交液由0.5mL的去离子甲酰胺、0.25mL的20×SSC、0.2mL的10％的封闭剂、0.01mL的10％SDS，以及0.05mL的2％的NLS组成。优选的，所述原位杂交的条件为：于杂交液中55-60℃孵育16-20小时，所述杂交液中cRNA探针的浓度为1-2μg/mL。优选的，所述漂洗、封闭具体包括将杂交后小鼠脑组织标本依次置于以下液体中进行的处理：于漂洗液中55-60℃漂洗2-3次，每次20-30分钟，漂洗液由0.5mL的去离子甲酰胺、0.1mL的20×SSC、0.05mL的2％的NLS以及0.35mL的双蒸水组成；于RNaseA终浓度为20μg/mL的RNase缓冲液中37℃孵育30-40分钟，RNase缓冲液由0.01mL的1MTris-HCl(pH8.0)、0.002mL的0.5MEDTA、0.1mL的5MNaCl以及0.888mL的双蒸水组成；于含0.1％NLS的2×SSC中37℃漂洗2-3次，每次20-30分钟；于含0.1％NLS的0.2×SSC中37℃漂洗2-3次，每次20-30分钟；于TS7.5中孵育10-20分钟；于TBS中孵育1-2小时(封闭)；所述针对地高辛的抗体选自Anti-Digoxigenin-POD，识别采用的孵育条件为：于含Anti-Digoxigenin-POD的TBS中孵育12-16小时，Anti-Digoxigenin-POD:TBS的体积比为1:500-1000。优选的，所述荧光显色具体包括以下步骤：将放大处理后的小鼠脑组织标本经TNT以及0.1MPB漂洗后，于含有标记FITC的avidin的TBS中避光孵育2-4小时，所述标记FITC的avidin选自Avidin,FITCconjugate，Avidin,FITCconjugate:TBS的体积比为1:500-1000。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术提出的cRNA探针针对Shank3基因的特异性高，在不同个体的脑组织中均可以高效完成Shank3基因的识别，可确保小鼠Shank3基因原位杂交显色的特异性和高效性。进一步的，本专利技术提出的扩增引物具有极高的特异性，可以特异性地扩增出shank3的目的基因片段，经blastn比对，没有其他同源序列。本专利技术对放大荧光显色效果中使用的反应试剂以及放大工艺条件(例如处理时间)进行了优化，可以特异性地放大杂交信号，实现了Shank3基因的cRNA探针原位杂交显色。基于TSA-Biotin放大的荧光显色可以同其他荧光原位杂交或免疫荧光显色结合使用，从而实现多重荧光原位杂交或原位杂交与免疫组化的多重标记。进一步的，本专利技术所用试剂组成更为简单，可分装放置，使用前再混合均匀，存放时间较长，经济便捷。附图说明图1为反义探针在小鼠大脑皮质的分布；图2为正义探针在小鼠大脑皮质的分布。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。所述实施例用于解释本专利技术，而非对本专利技术的限定。本专利技术构建了小鼠Shank3基因的cRNA探针，并通过荧光原位杂交的方法清晰显示了小鼠Shank3基因在正常小鼠脑组织中的表达情况，为进本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小鼠Shank 3基因cRNA探针，其特征在于：该cRNA探针包括与小鼠Shank 3基因mRNA参考序列NM_021423.3的3465‑4108位互补的核苷酸序列，或者包括该核苷酸序列的同源序列。
【技术特征摘要】
1.一种小鼠Shank3基因cRNA探针，其特征在于：该cRNA探针包括与小鼠Shank3基因mRNA参考序列NM_021423.3的3465-4108位互补的核苷酸序列，或者包括该核苷酸序列的同源序列。2.根据权利要求1所述一种小鼠Shank3基因cRNA探针，其特征在于：所述cRNA探针的序列如SEQ.ID.NO.3所示。3.根据权利要求1所述一种小鼠Shank3基因cRNA探针，其特征在于：所述同源序列是以小鼠脑组织cDNA为模板，并使用以下引物扩增得到的：上游引物：5’-ACCCGAGACTCTGAGAGAGG-3’；下游引物：5’-AATGGTGCTTGTGGTCTCCA-3’。4.根据权利要求1所述一种小鼠Shank3基因cRNA探针，其特征在于：所述cRNA探针上标记有地高辛。5.一种小鼠Shank3基因原位杂交显色方法，其特征在于：包括以下步骤：1)制备用于原位杂交的小鼠脑组织标本；2)将小鼠脑组织标本依次经过杂交前处理、杂交预处理后置于杂交液中进行原位杂交；所述原位杂交中采用的杂交液由杂交预处理中使用的预杂交液和小鼠Shank3基因cRNA探针组成，所述cRNA探针包括与小鼠Shank3基因mRNA参考序列NM_021423.3的3465-4108位互补的核苷酸序列，或者包括该核苷酸序列的同源序列；该cRNA探针上标记有地高辛；3)杂交完成后依次进行漂洗、封闭，然后利用针对地高辛的抗体对结合在小鼠脑组织标本上的cRNA探针进行识别；然后利用TSA-biotin对结合在小鼠脑组织标本上的cRNA探针进行放大处理，然后进行荧光显色；TSA-biotin由0.05gBSA、5μLtyramide-biotin、15μL的1.0mg/mL葡萄糖氧化酶、50μL的200mg/mLβ-D-葡萄糖以及5mL0.1MPB组成；放大处理的条件为：经TNT以及0.1MPB漂洗后，于TSA-biotin中避光孵育20-40分钟。6.根据权利要求5所述一种小鼠Shank3基因原位杂交显色方法，其特征在于：所述杂交前处理中，将小鼠脑组织标本依次置于以下液体中进行处理：含体积分数1-3％H2O2的0.1MDEPC-PB中避光孵育10-20分钟；0.1MDEPC-PB中漂洗10-20分钟；含体积分数0.3％TritonX-100的0.1MDEPC-PB中孵育20-30分钟；...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晶，郭保霖，蔡国洪，吴菲菲，武胜昔，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61
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