一种快速鉴定普通小麦A、B、D基因组染色体的方法技术

本发明专利技术提供了一种快速鉴定普通小麦A、B、D基因组染色体的方法。本发明专利技术首先提供3条寡核苷酸探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑3所示，探针SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2能够分别在小麦B和D基因组染色体上产生全覆盖式的明显清晰的信号，探针SEQ ID NO.3在A基因组染色体上产生明显清晰的信号。将3条探针相结合用于ND‑FISH，能同时将普通小麦A、B、D基因组染色体截然地区分开，还能鉴定发生在小麦中的染色体组间易位的染色体，具有操作简便、用时短、成本低的优点。在小麦育种领域具有良好的应用前景。

A method for rapid identification of genomic chromosomes of A, B and D in common wheat

The present invention provides a method for rapid identification of genomic chromosomes of A, B and D of common wheat. The invention firstly provides 3 oligonucleotide probes, the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 respectively as 3, SEQ ID NO.1 probe and SEQ ID NO.2 can generate full coverage of the clear signal in wheat B and D genome chromosomes, SEQ ID NO.3 probe obviously clear signals in the A gene on chromosome. The 3 probe combination for ND FISH, can also separate the common wheat A, B, D genome chromosome translocation between chromosomes completely, can occur in the identification of wheat chromosomes, has the advantages of convenient operation, short time, low cost. It has a good application prospect in the field of wheat breeding.

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定普通小麦A、B、D基因组染色体的方法
本专利技术涉及分子细胞遗传学领域，特别是涉及利用寡核苷酸探针采用ND-FISH方法检测小麦A、B、D基因组染色体以及小麦染色体组间易位染色体的方法。
技术介绍
高等生物染色体序列复杂多样，在不同区间存在大量的重复序列，这为标记与鉴定染色体提供了新的思路与方法。在分子细胞遗传学领域，可通过构建重复序列探针对染色体进行标记，分析染色体上探针信号的分布状态，从而区分基因组与染色体组。此外，通过比较染色体上探针信号的变化亦是分析染色体行为的普遍做法。普通小麦由三个不同的二倍体祖先种融合进化而来，含有A、B和D三个基因组，是典型的异源六倍体。因此，普通小麦是研究物种进化的有用材料(Marcussenetal.2014)。同时，普通小麦也是重要的粮食作物。对普通小麦的三个基因组进行准确鉴定和识别，有利于研究小麦基因组的进化和发现小麦基因组间的染色体易位，从而研究易位染色体的功能作用。因此，快速准确鉴定小麦A、B、D三个基因组的染色体显得十分重要，尤其是对三个基因组间的染色体易位的准确鉴定，对易位染色体在小麦育种中的应用有极大的帮助。尽管目前已有原位杂交技术能够达到此目的，但目前用于鉴定小麦A、B、D三个基因组染色体的原位杂交技术都各自存在缺陷，技术手段需要更新。一方面，要找到能分别在A、B、D三个基因组或其中两个基因组的染色体上产生全覆盖式信号的特异探针，即该探针要么只在A基因组染色体上产生全覆盖式信号，要么只在B基因组染色体上产生全覆盖式信号，或只在D基因组染色体上产生全覆盖式信号；另一方面，找到的特异探针方便制备，探针与染色体杂交过程简化。GISH(Genomeinsituhybridization，基因组原位杂交)：用经标记的动植物总基因组DNA作探针，与动植物染色体进行杂交，探明外源染色体的存在及存在方式。现有技术是以普通小麦祖先材料Triticumurartu,Aegilopsspeltoides和Aegilopstauschii的基因组DNA为探针，将三种基因组DNA标记成不同的颜色，利用多色基因组原位杂交(multicolorGISH)技术将普通小麦A、B、D三个基因组染色体区分开，这三种基因组DNA探针在染色体上的分布方式是全覆盖式的(Hanetal.2004)。multicolorGISH技术需要从三种小麦祖先材料Triticumurartu,Aegilopsspeltoides和Aegilopstauschii中提取基因组DNA，然后分别对三种基因组DNA进行标记。探针标记好后，在进行原位杂交过程中，要对探针和染色体进行变性，然后杂交过夜。该过程十分繁琐，费时费力，而且探针标记的成本也高。FISH(fluorescenceinsituhybridization，荧光原位杂交)：用经标记的DNA序列作探针，与动植物染色体进行杂交，明确探针序列在染色体上的分布，建立染色体特定界标，从而达到识别染色体、了解染色体的结构功能和基因组进化的目的。利用常规FISH技术鉴定普通小麦A、B、D三个基因组染色体(Zhangetal.2004；Komuroetal.2013)。克隆普通小麦A、B、D组特异的重复序列，以这样的重复序列为探针，用FISH技术鉴定小麦A、B、D染色体。这种方法也能很好地将普通小麦A、B、D三个基因组染色体区分开，其效果类似multicolorGISH技术。但是常规FISH技术所需探针的制备过程也非常繁琐。首先需要获得大量的特异重复序列，这涉及克隆、转化感受态大肠杆菌、质粒提取等繁杂过程。另外，与GISH技术一样，获得的重复序列还需要标记，要购买标记试剂盒，成本高。探针与染色体杂交之前，探针和染色体也都需要变性。因此常规FISH技术过程复杂，成本高。C-带技术(C-banding)是植物染色体经一定条件处理后，用Giemsa染料进行染色，在不同染色体上显示出染色深浅不一的带纹，不同染色体显示出的带纹模式不同，达到识别染色体的目的。C-带技术也可以用来鉴定普通小麦A、B、D三个基因组染色体(FriebeandGill1994)。通过C-带技术，可以显示小麦不同染色体的不同带型，从而将A、B、D三个基因组染色体区分开。但C-带技术流程长，过程繁杂，也不是全染色体覆盖的，尤其是A和D基因组的染色体，带纹不丰富。因此，只有当小麦染色体或染色体臂处于完整状态时，C-带技术才能准确识别染色体，如果染色体的断裂和易位发生在带纹不丰富或没有的区域，就不能识别。ND-FISH(non-denaturingfluorescenceinsituhybridization，非变性荧光原位杂交)：通常以合成的单链寡核苷酸为探针，与非变性的染色体进行原位杂交，能够低成本、快速、方便地明确探针序列在染色体上的分布，建立染色体特定界标，从而达到识别染色体、了解染色体的结构功能和基因组进化的目的。利用寡核苷酸探针Oligo-pAs1、Oligo-pSc119.2和Oligo-pTa535，结合ND-FISH技术，能够快速准确鉴定小麦A、B、D三个基因组的染色体(Tangetal.2014；Fuetal.2015)。该技术的缺点在于，所用寡核苷酸探针是根据已有的串联重复序列pSc119.2、pAs1和pTa-535设计而来，其杂交效果与原重复序列效果一样，主要在A、B、D三个基因组染色体的端部和亚端部产生杂交信号，在少数染色体的臂间产生几个信号点，都不是以全覆盖的方式在染色体上产生杂交信号。因此，只有当小麦染色体或染色体臂处于完整状态时，这些探针才能准确识别染色体，如果染色体的断裂和易位发生在这些探针信号没有的区域，就不能识别。
技术实现思路
为克服现有技术的上述不足，本专利技术目的在于提供一种能区分小麦A、B、D基因组染色体、能鉴定小麦染色体组间易位染色体的方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：(1)从公共数据库InternationalWheatGenomeSequencingConsortium(IWGSC)下载小麦基因组参考序列(IWGSC_RefSeq_V1)。(2)用TandemRepeatsFinder软件(http://tandem.bu.edu/trf/trf.html)注释小麦基因组中的串联重复序列，得到约390万条串联重复序列。(3)用Python语言编程对得到的全部串联重复序列进行初步筛选，筛选条件为串联重复序列的重复单元(PeriodSize)大于6。(4)用Python语言编程将第(3)步筛选得到的串联重复序列按照重复单元大小(PeriodSize)分为4类(30-100，100-200,200-300，>300)。(5)用CD-HIT软件(http://weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit/)设定相似度阈值75％，对第(4)步筛选得到的4类串联重复序列进行聚类(即相似度高于75％的序列聚为一类)，并统计每个类中的串联重复序列的拷贝数(copynumber)的总和。(6)用Python语言编程提取拷贝数总和大于1000的同一类序列，并提取一致性序列(CONSENSUS)。(7)用Blast本地化工具，将第本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴别小麦B基因组染色体的寡核苷酸探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.用于鉴别小麦B基因组染色体的寡核苷酸探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.用于鉴别小麦D基因组染色体的寡核苷酸探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.用于鉴别小麦A基因组染色体的寡核苷酸探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.一种寡核苷酸探针组合，其特征在于，含有3条寡核苷酸探针，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-3所示。5.权利要求1-3任一所述的寡核苷酸探针或权利要求4所述的寡核苷酸探针组合在鉴定小麦A、B、D基因组染色体或在小麦种质资源改良或育种中的应用。6.权利要求4所述的寡核苷酸探针组合在检测小麦染色体组间易位染色体中的应用。7.一种检测小麦A、B、D基因组染色体的方法，其特征在于，利用权利要求4所述的寡核苷酸探针组合对待测小麦材料进行ND-FISH方法检测。8.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：符书兰，唐宗祥，汤述尧，邱玲，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51