抗逆小麦新类型培育方法技术

一种抗逆小麦的培育方法，其特征是将抗逆转录因子ＤＲＥＢ转录因子导入小麦，从获得的转基因植株中筛选出抗逆性综合改良的转基因小麦。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用基因转化方法进行抗逆小麦新类型培育的方法。
技术介绍
环境胁迫，如干旱、盐渍、低温等是世界上植物生产的重要限制因素。近年来，我国小麦因逆境造成的年均受灾面积高达20％～25％。干旱、盐渍、低温等逆境因子已成为大幅度提高我国小麦单产及总产水平的主要限制因素之一。用常规育种方法选育抗盐、耐旱小麦，由于遗传资源的匮乏而很难选到所需要的类型；而把盐生植物的耐盐性传递给小麦的远缘杂交的方法，又受到远缘杂交不亲和性的限制。利用植物基因工程技术，克隆、鉴定目的基因，将目的基因转化到目标植物中并获得转基因植株，是培育抗逆小麦的新途径。但是，小麦的抗盐、耐旱等抗逆性是由多基因控制的数量性状，其生理、生化过程是基因相互作用、共同调节的结果。单个抗性基因转入小麦很难使小麦的抗逆性得到大的改善。已有人发现，DREB转录因子和DRE元件在干旱、高盐及低温胁迫信号传递中起重要作用，一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达。(刘强，赵南明等.DREB转录因子在提高植物抗逆中的作用，科学通报，2000，45(1)11～16；Liu Q，Kasuga M，et al.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with anEREBP/AP2 DNA-binding domain separate two cellular signal transduction pathways indrought-and low-temperature-responsive gene expression in Arabidopsis.Plant Cell，1998，101391～1406)。如有人利用DREB1A基因转化拟南芥，发现在转基因拟南芥植物中，DREB1A在正常条件下或在胁迫条件下的超表达，促使多个与胁迫相关基因在正常条件下也能表达，或在胁迫条件下表达进一步增强，从而使植株对干旱、高盐及低温的耐性得到全面的显著增强。(Kasuga M，Liu Q，et al.Improving plant drought，salt，and freezing toleranceby gene transfer of a single stress-inducible transcription factor.Nature Biotechnology，1999，17287～292)。但是利用DREB1A基因导入小麦培育抗逆小麦新类型的工作尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是将抗逆转录因子DREB1A基因导入小麦，从获得的转基因植株中筛选出抗逆性综合改良的转基因小麦。本专利技术通过基因枪法将克隆自拟南芥的DREB抗逆转录因子转入小麦，经过芽期抗逆性鉴定，筛选出2个兼抗株系TG02-002-1、TG02-001-7，两个株系都兼具抗盐和耐旱特性。具体实施例方式以下实施例中使用下述材料与方法1.试验用小麦H6756和藁城8901小麦(Triticum aestivum L.)2.质粒中国农业科学院作物育种栽培研究所构建的pAHC25/DREB1A质粒。3.培养基愈伤组织的诱导培养基为MS+2mg/l 2.4-D高渗培养基为MS+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇诱导筛选培养基MS+0.2mg/L 2，4-D+5mg/L Basta分化筛选培养基MS+5mg/L Basta芽苗伸长培养基MS+0.2mg/lNAA+1.5mg/lBA生根培养基1/2MS+0.2mg/L IAA4.PCR反应条件PCR反应体系为10μL，反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50s，41℃复性40s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min，4℃保存。5.350mMolNaCl溶液配制在1/1000天平上称取NaCl10.227g，放置500ml容量瓶内，加蒸馏水搅拌定容至500ml。6.相对盐害率计算 注CK1、CK2和CK3分别为对照的三个重复发芽种子数T1、T2和T3分别为盐胁迫处理的三个重复发芽种子数7.30％PEG溶液配置称取30gPEG(聚乙二醇6000)，放置100ml容量瓶内，加蒸馏水搅拌定容至100ml。8.干旱伤害率干旱伤害率＝(正常发芽种子数-高渗发芽种子数)/正常发芽种子数×100％ 实施例1小麦基因枪转化一.方法1.接种将H6756和藁城8901小麦护颖分化期至雌雄蕊原基分化期的幼穗作为外植体接种于诱导培养基上；2.基因枪转化接种一周左右在愈伤组织生长旺盛期，用基因枪轰击幼穗愈伤组织，将克隆自拟南芥的DREB抗逆转录因子导入小麦，基因枪转化方法参照基因枪操作手册进行；3.恢复培养将愈伤组织转至诱导培养基上恢复培养；4.愈伤组织抗性筛选将上述愈伤组织转至诱导筛选和分化筛选培养基上进行Basta抗性筛选；5.芽苗分化将经筛选的愈伤组织转至芽苗伸长培养基上；6.壮根、移栽再生绿苗转至生根培养基上壮苗，然后将含有健壮根系的绿苗经0～4℃春化处理，炼苗移栽。7.转化株叶片筛选移栽幼苗长至15cm高时，用棉签沾取100mg/L的Basta溶液涂抹转化株的叶片，10天后观察叶片坏死情况。8.转化植株的PCR检测剪取具有除草剂抗性的转化株的叶片，采用CTAB法提取总DNA。引物序列上游引物5′-TTTAGTTACCTTATCCAGT-3′；下游引物5′-TGACTCTTTGCTCAC ATT-3′，由博雅公司合成。二.小麦基因转化结果1.愈伤组织的抗性筛选用基因枪共轰击H6756幼穗诱导的胚性愈伤组织932块，藁城8901幼穗诱导的胚性愈伤组织49块。轰击后的愈伤组织恢复培养后转到诱导筛选培养基上进行第一次诱导筛选，多数愈伤组织能够正常生长，只有少数愈伤组织变褐死亡。将生长正常的幼穗愈伤组织再转到诱导筛选培养基上进行第二次筛选，大部分愈伤组织褐化死亡。选择生长正常的抗性愈伤组织转至分化筛选培养基上再次筛选后，经过芽苗伸长培养和壮根培养，共获得了218株转化植株，其中H6756获得205株，藁城8901获得13株。以最初轰击愈伤组织块数为基数计算，转化植株的频率分别为22.0％和26.5％。2.转化株的抗性筛选移栽苗长至15cm高时，用棉签沾取100mg/L的Basta溶液涂抹转化株的叶片，H6756的转化植株中有89株表现抗性，藁城8901在有5株抗性株，频率分别为9.6％和10.2％。3.转基因植株的分子检测对筛选获得的94株除草剂抗性植株，分别提取叶片DNA进行PCR检测。结果H6756有50株扩增出预期的1.0kb左右的特异性条带，藁城8901有4株扩增出预期的1.0kb左右的特异性条带，与质粒扩增的条带大小相同，而非转化株对照植株中未扩增出相应的条带。H6756阳性株率为5.36％；藁城8901阳性株率为8.16％，初步表明外源DREB1A基因已存在于转基因小麦中。实施例2转基因小麦株系芽期耐盐性鉴定一.鉴定方法及判断标准1.样品准备每个株系取600粒种子在空气干燥箱内35℃恒温加热干燥3d，冷却至室温待测。2.胁迫培养在长11cm×宽11cm×高3cm培养皿中放置无菌滤纸，将300粒种子设为3次重复，每个重复100粒，腹沟向下，粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘录祥，赵林姝，梁欣欣，郑企成，王晶，赵世荣，郭会君，陈文华，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物育种栽培研究所，
类型：发明
国别省市：