一种筛选抗叶锈病小麦的方法及其专用引物技术

本发明专利技术公开了一种筛选抗叶锈病小麦的方法及其专用引物。用于筛选抗叶锈病小麦品种的特异性引物，是由序列表中引物ｗｍｓ５８２和ｂａｒｃ８的上下游核苷酸序列组成的引物对。该筛选抗叶锈病小麦的方法，是以待测小麦基因组ＤＮＡ为模板，分别在上述引物对的引导下，进行ＰＣＲ扩增，检测扩增产物中是否有１３９ｂｐ和１８０ｂｐ大小的条带。ＳＳＲ标记Ｘｗｍｓ５８２和Ｘｂａｒｃ８的连锁距离分别为３．９ｃＭ和５．２ｃＭ，与上述ＳＳＲ标记紧密连锁的抗叶锈病基因对我国目前流行的大多数小种表现抗病。利用该抗病基因紧密连锁的分子标记可以对其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。本发明专利技术的新抗病基因及其专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种筛选抗叶锈病小麦的方法及其专用引物。技术背景小麦叶锈病是一种世界性病害，其分布范围比条锈病和秆锈病更广。小麦叶锈病菌适应 不同的气候条件，可在全世界不同的小麦种植区发生，若条件适宜可造成40%'甚至更大的产 量损失(KnotU989)。在我国，小麦叶锈病过去主要在西南及长江流域的部分地区如贵州、江 西等省发生较重，近年来华北、西北及东北各地也日趋严重。在我国1969年、1973年、1975 年和1979年曾几度大面积流行，造成严重减产。1998年，小麦叶锈病在全国较大范围内流 行，山东鲁西南等地发病严重，后期病叶率达70—80%，严重的达100%，部分田块减产20% 以上(国家灾害综合研究组，http:〃210.72.100.6/aspx/grid.aspx Dl=708)。利用抗叶锈品种 是减轻叶锈病危害的最经济、有效、快捷的方法。目前已有60个抗叶锈病基因正式命名 (Mcintosh etal. 2007)，其中大多数具有生理专化性，这些抗病基因往往会由于病菌小种的变 异而很快"丧失"抗性。育种学家和植病学家希望通过利用多基因聚合、基因布局和多系品种 来延长苗期抗病基因的抗性寿命。要实现多基因聚合、基因布局和多系品种，必须有丰富的 有效抗源，目前已知的有效抗病基因仅有丄W,i:W9,丄r24和丄r3S，因此寻找和发掘新的抗源 异常重要。分子标记(包括RAPD、 RFLP、 SSR和RGAP)在小麦的基因作图中得到了广泛应用， 近年来，利用分子标记定位和标记了多个小麦抗叶锈病基因。SSR标记由于其多态性高、共 显性、稳定性好及染色体位置清楚适合基因定位和作图而得到了广泛应用，紧密连锁的SSR 标记可用于标记辅助选择和聚合育种。'1984年育成的小麦品系周8425B是一个很好的抗病育种材料，目前抗我国大多数叶锈菌 生理小种。以周8425B为亲本材料已育出三十多个推广品种，种植面积达600万公顷。我们 对周8425B进行苗期基因推导发现其可能含有新的抗叶锈病基因，进一步通过对周8425B和 中国春杂交产生的F,、 F2和F3群体进行遗传分析和分子标记，将抗病基因定位于1BL染色 体上，找到与其紧密连锁的SSR标记，并用于标记辅助育种。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可用于筛选抗叶锈病小麦的方法及筛选抗叶锈病 小麦的专用引物。本专利技术所提供的用于筛选抗叶锈病小麦的分子标记分别是IgM;m5S2和^mrS,标记 Zgwm5W由引物wms582扩增获得，该引物由序列表中其上游序列(20个碱基)和下游序列 (20个碱基)组成；标记^^rS由引物barc8扩增获得，该引物由其上游序列(27个碱基) 和下游序列(28个碱基)组成(见表l)。表1用于检测抗叶锈基因的两引物上下游序列引物名称上游序列下游序列wms5825' AAGCACTACGAMATATGAC 3'5' TCTTAAGGGGTGTTATCATA 3'barc85' GCGGGAATCATGCATAGGAAAACAGM 3'5' GCGGGGGCGAAACATACACATAAAAACA 3，本专利技术所提供的筛选抗叶锈病小麦的方法，是以待测小麦品种基因组DNA为模板，分 别用引物wms582和barc8进行PCR扩增，检测扩增产物中是否分别有139bp和180bp的条 带。如扩增产物中有139bp和180bp的条带，则待测品种为抗叶锈病小麦品种。20nlPCR反应体系为模板DNA60ng， Taq酶1U，上、下游引物(4nmol'U1)各1.2 ^L， dNTP (10mmol七—1) O.化L， 10xPCR缓冲液2 ^iL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20pL。 反应程序是94'C预变性4min，随后进行35个循环94"变性lmin， 5(TC退火lmin， 72°C 延伸lmin;最后72。C延伸10min, 4 。C保存。所述检测扩增产物的方法可为对扩增产物进行6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银 染显色。具体方法可为取20(iL扩增产物，加入8nL变性载样指示剂(98%无离子甲酰胺， 10mMEDTApH8.0， 0.25%溴酚蓝和0.25%二甲苯氢氟)，94。C变性10min后，立即放入冰 水混合物中冷却，每份变性的扩增样品取5pL在浓度为6%的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分 离，银染显色。检测扩增产物中是否有139bp和180bp大小的条带。本专利技术提供了一个新的小麦抗叶锈病基因^Z//5^的SSR标记Zgww5S2和^ZwrcS，连 锁距离分别为3.9cM和5.2cM， 对我国目前流行的大多数小种表现抗病。利用与该抗病基因紧密连锁的分子标记可以对其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累 加，延长品种的抗病性。本专利技术的新抗病基因及其专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作 用。附图说明下面结合具体实施例对本专利技术做进一歩详细说明。图1为用微卫星引物wms582对抗感亲本、抗感池和F2群体单株的PCR扩增结果； 图2为用微卫星引物barc8对抗感亲本、抗感池和F2群体单株的PCR扩增结果； 图3为7个SSR标记与该抗病基因的连锁图。具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有引物合成均由上海生工完成。 小麦材料周8425B由河南省周口市农科院选育。 实施例1小麦抗叶锈病新基因的SSR标记J^wm5W和J wcS的获得及基因来源鉴定 一、小麦抗叶锈病新基因的SSR标记JTgw附5S2和JKwrS的获得用我国目前强毒力叶锈菌生理小种THTT对小麦材料周8425B和中国春(亲本)的Fi、 F2和F3代群体进行苗期抗病性鉴定，共鉴定F,群体16株，F2群体487株，136F3家系，周 8425B表现中抗，中国春表现感病，Fi全部抗病，F2中有359株表现抗病，128株表现感病， 抗感分离符合3: 1 (x2=0.43， P>0.5) 。 136个F3家系中29个家系表现纯合抗病，67个家系表现抗感分离，40个家系表现为感病。F3家系分离比例为纯合抗抗感分离纯合感=1:2: 1 (X2=1.81, P>0.25)，表明周8425B中含有一个显性抗病基因，暂命名为ZrZi/W。从 F2代单株中选用20个抗病单株和20个感病单株分别组成抗病池和感病池。选用793个SSR弓I物，其中GWM (Gatersleben wheat microsatellite)系列引物240个，WMC (Wheat Microsatellite Consortium)系列引物543个，8个BARC系列引物，2个CFA系列引物， 所有引物序列源自美国农业部网站http:〃wh.eat.pw.usda.gov/GG2/quickquery.shtml，以周 8425B、中国春、抗病池和感病池的基因组DNA为模板，进行PCR检领(J， 20pLPCR反应体系 为模板DNA60ng， Taq酶1U，上、下游引物"pmol.L-1)各1.2pL， dNTP (10mmo1.1/1) 0.4nL， 10xPCR缓冲液2pL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20nL。 PCR反应程序为先94。C 4min;然后94。C lmin， 本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于筛选抗叶锈病小麦的引物，是由序列表中引物ｗｍｓ５８２和ｂａｒｃ８的上下游核苷酸序列组成的引物对。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘大群，李在峰，杨文香，赵晓丽，张汀，张立荣，王海燕，孟庆芳，闫红飞，李星，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]