一种全细胞催化生产L‑赤藓酮糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种全细胞催化生产L‑赤藓酮糖的方法，其特征为通过构建含有甲醛连接酶和D‑果糖‑6磷酸醛缩酶的大肠埃希氏菌重组菌株，并制备全细胞催化剂，以单一甲醛或者组合甲醛和二羟丙酮合成L‑赤藓酮糖，该方法可以耐受底物浓度为1.5mol/L，合成153g/L L‑赤藓酮糖，采用该全细胞催化剂循环反应10次，仍可以保持73％转化率；采用固定化细胞策略可以提高底物耐受浓度至2mol/L，循环转化10次，仍可以保持53％转化率。相比目前报道的发酵法生产，具有底物耐受浓度高、产物合成效率高、产物单一便于分离的优势，具有工业化应用潜力，该方法具有底物廉价、转化率高的优点，为一碳化合物的高附加值利用提供基础。

【技术实现步骤摘要】
一种全细胞催化生产L-赤藓酮糖的方法
本专利技术属于生物制造领域，具体涉及一种全细胞催化合成L-赤藓酮糖的方法。
技术介绍
L-赤藓酮糖是一种稀有糖，其主要用途是作为人工美黑剂，应用于化妆品行业，该化合物与皮肤外部或者老死表层中的角蛋白氨基酸发生反应，使皮肤变成棕色，进而起到美黑效果，该美黑效果不存在引起皮肤癌变的风险，同时还可有效阻止皮肤水分的过度蒸发，起到保湿、防晒的作用；该化合物和目前常用的美黑剂化合物二羟丙酮相比，具有使皮肤缓慢变黑、可产生自然、同质和持久的棕褐色、无特殊气味、皮肤安全、可为肌肤补水等优点。此外L-赤藓酮糖还是多种抗感染药物的前体，作为鞣剂的主要成分应用于医药、工业等领域，具有很高的应用价值。L-赤藓酮糖主要通过微生物以赤藓糖醇为底物发酵生产，这些工业菌株大都含有赤藓糖醇脱氢酶。目前报道较多的L-赤藓酮糖生产菌株为葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter)和醋杆菌属(Acetobacter)，如GluconobacteroxydansATCC621、GluconobacteroxydansDSM7145、Acetobactersuboxydans、Acetobacterxylinum等。中国专利文献CN103952334A(申请号201410112899.6)公开了一种微生物发酵生产L-赤藓酮糖的菌株HD385和方法，该菌株发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，其在好氧条件下能显著地积累L-赤藓酮糖，然而该方法存在底物耐受性差、产率低、分离提取成本高等问题，所以有必要开发一种底物耐受浓度高、生产速率高、分离纯化成本低、环境友好等L-赤藓酮糖合成方法。专利技术目的本专利技术目的之一是提供一种生产L-赤藓酮糖的方法，其特征在于：甲醛连接酶和D-果糖-6-磷酸醛缩酶催化甲醛生成L-赤藓酮糖。在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述的甲醛连接酶来源于荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶来源于大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)。在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述的甲醛连接酶的氨基酸序列为(a)或(b)：(a)SEQIDNO：1，(b)与SEQIDNO：1具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为(c)或(d)：(c)SEQIDNO：2，(d)与SEQIDNO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列。在更优选的实施方式中，本专利技术目的上述的任一方法，其特征在于，催化反应体系中甲醛含量10-100mM，优选的甲醛含量50mM，缓冲液pH为6-8，优选pH为7.5，催化反应条件为20℃-37℃，优选的温度30℃，反应时间2-24小时，优选反应时间24小时。本专利技术目的之二是提供一种在存在全细胞催化剂的条件下循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征在于：底物为甲醛和二羟丙酮，所述全细胞催化剂包含D-果糖-6-磷酸醛缩酶。在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为(a)或(b)：(a)SEQIDNO：2，(b)与SEQIDNO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列。在更优选的实施方式中，本专利技术目之二的上述的方法，催化的反应体系中添加全细胞催化剂，直至菌体初始密度OD600为40-120，优选的菌体初始密度为80，甲醛1-2mol/L，优选甲醛1.5mol/L，二羟丙酮1-2mol/L，优选二羟丙酮1.5mol/L；催化反应条件为，温度为25-30℃，pH为6-8，反应时间为2-4h；反应结束后，离心分别收集上清和沉淀，沉淀作为全细胞催化剂再次催化合成L-赤藓酮糖。在最优选的实施方式中，本专利技术目之二的上述的任一方法，其特征在于，循环次数2-10次，优选的10次。本专利技术目的之三是提供一种应用固定化全细胞珠循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征在于，以海藻酸钠为固定化材料，包埋含有D-果糖-6-磷酸醛缩酶的大肠杆菌重组菌株，制备成固定化全细胞珠，催化甲醛和二羟丙酮合成L-赤藓酮糖。在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为(a)或(b)：(a)SEQIDNO：2，(b)与SEQIDNO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列。在更优选的实施方式中，本专利技术目的上述的固定化细胞循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征在于，催化的反应体系中固定化细胞材料含量为5-15g/L，优选的固定化细胞材料含量为10g/L，甲醛1-2mol/L，优选的甲醛2mol/L，二羟丙酮1-2mol/L，优选的二羟丙酮2mol/L；催化反应条件为，温度为25-30℃，pH为6-8，反应时间为2-4h；反应结束后，离心分别收集上清和沉淀，沉淀作为固定化全细胞珠再次催化合成L-赤藓酮糖。在最优选的实施方式中，本专利技术目之三的上述任一的方法，其特征在于，循环次数为2-10次，优选的10次。本专利技术目的四：提供一种以甲醛为单一底物全细胞催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征为构建含有来源于荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)的甲醛连接酶(formolase)(序列表SEQIDNO：1)和来源于大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)果糖-6-磷酸醛缩酶(D-fructose-6-phosphatealdolase，FSA)的突变体(序列表SEQIDNO：2)的重组大肠杆菌1，并用重组菌株1制备全细胞催化剂，以甲醛为唯一底物合成L-赤藓酮糖。所述甲醛连接酶FLS催化甲醛转化为二羟丙酮，所述果糖-6-磷酸醛缩酶FSA催化甲醛和二羟丙酮合成L-赤藓酮糖。所述全细胞催化体系包括底物甲醛10-100mM，全细胞催化剂(10-20gCDWL-1)，三乙醇胺缓冲液(50mM，pH7.5)，反应条件为：温度30℃，转速120rpm，反应12h。所述全细胞催化剂的制备方法包括以下步骤：挑取含有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因的大肠埃希氏菌重组菌株单菌落，接种至4mLLB培养基中，在37℃、200rmp条件下，培养过夜。按照1％的接种量，将种子液接种于100mL培养基中，在37℃、200rmp条件下，培养2-3h；当菌体浓度OD600达到0.6-0.8时，添加终浓度为1mmol的IPTG，同时降低培养温度至20℃，摇床转速降低至120rmp，诱导时间为20h；将诱导得到的大肠埃希氏菌重组菌株菌液，4℃、6000rmp离心10min收集菌体，并用三乙醇胺缓冲液(50mmolpH7.0)洗涤菌液三次，最终用三乙醇胺缓冲液浓缩，制成全细胞催化剂。本专利技术目的五：提供一种全细胞循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征为，构建含有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因的大肠杆菌重组菌株2，并用重组菌株2制备全细胞催化剂，以甲醛和二羟丙酮为底物合成L-赤藓酮糖，全细胞催化剂可以循环使用多次，并保持较高的转化率。所述全细胞催化反应体系包括全细胞催化剂(10-30gCDWL-1)，二羟丙酮1-2mol/L，甲醛1-2mol/L，三乙醇胺(100m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产L‑赤藓酮糖的方法，其特征在于：甲醛连接酶和D‑果糖‑6‑磷酸醛缩酶催化甲醛生成L‑赤藓酮糖。

【技术特征摘要】
1.一种生产L-赤藓酮糖的方法，其特征在于：甲醛连接酶和D-果糖-6-磷酸醛缩酶催化甲醛生成L-赤藓酮糖。2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甲醛连接酶来源于荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶来源于大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)。3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甲醛连接酶的氨基酸序列为(a)或(b)：(a)SEQIDNO：1，(b)与SEQIDNO：1具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为(c)或(d)：(c)SEQIDNO：2，(d)与SEQIDNO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列。4.权利要求1-3的任一方法，其特征在于，催化反应体系中甲醛含量10-100mM，优选的甲醛含量50mM，缓冲液pH为6-8，优选pH为7.5，催化反应条件为20℃-37℃，优选的温度30℃，反应时间2-24小时，优选反应时间24小时。5.一种在存在全细胞催化剂的条件下循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征在于：底物为甲醛和二羟丙酮，所述全细胞催化剂包含D-果糖-6-磷酸醛缩酶。6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为(a)或(b)：(a)SEQIDNO：2，(b)与SEQIDNO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨建刚，孙媛霞，朱玥明，戴隆海，张颖，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12