褐藻胶裂解酶在制备系列寡糖产物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程重组型褐藻胶裂解酶在制备系列寡糖产物中的应用。M‑专一性褐藻胶裂解酶在降解底物生成系列不饱和寡糖产物中的应用；所述重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Pae‑rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者，所述重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Avi‑rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。褐藻胶裂解酶Pae‑rEAlgL和Avi‑rEAlgL是M专一性的内切型褐藻胶裂解酶，是一种高效的制备富G段寡糖的工具酶。褐藻胶裂解酶Pae‑rEAlgL和Avi‑rEAlgL具有适冷特性和广泛的pH稳定性，有望成为用于治疗囊性纤维病的酶制剂。

【技术实现步骤摘要】
褐藻胶裂解酶在制备系列寡糖产物中的应用
本专利技术涉及褐藻胶裂解酶在制备系列寡糖产物中的应用，特别涉及两种甘露糖醛酸(M)专一性的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL在降解由M和古罗糖醛酸(G)混合组成的商品化褐藻胶多糖制备不饱和二糖、不饱和三糖、不饱和四糖、不饱和五糖、不饱和六糖和不饱和七糖的系列寡糖产物中的应用，属于酶工程

技术介绍
褐藻胶(Alginate)与琼胶，卡拉胶并称三大海洋多糖。褐藻胶的主链是由β-D-1,4-甘露糖醛酸(Mannuronate,M)及其C-5差向异构体α-L-1,4-古罗糖醛酸(Guluronate,G)两种糖单元通过β-1,4糖苷键链接而成的线性多糖分子。其中，由连续的M糖单元组成的糖链称为聚M段(Mblock)，连续的G糖单元组成的糖链称为聚G段(Gblock)，不同的糖单元交替链接称为MG或GM段(MGblocks)。褐藻胶广泛存在于海带，巨藻和马尾藻等大型藻类的细胞壁和胞间质中。某些微生物，如铜绿假单胞菌和棕色固氮菌，也能合成并分泌褐藻胶。与海藻来源的褐藻胶不同，细菌所分泌的褐藻胶在糖单元的O-2或O-3位具有一定程度的乙酰基修饰。褐藻胶无毒无害，具有良好的吸水成胶能力，是良好的支撑材料，因而广泛应用于化工、医药和食品行业。研究还表明，褐藻胶寡糖具有重要生物活性，如抗凝血、降血糖、降血脂、抗自由基、抗肿瘤、免疫保护、促植物生长等。深入研究表明：(1)聚M段和MG段可激活单核细胞，使其产生肿瘤坏死因子TNF-A、IL-1与IL-6，因而具有抗肿瘤活性；(2)耿美玉等以聚M段褐藻胶寡糖为原料，研制的一类候选药物971，具有抗β-淀粉样蛋白聚集活性，可用于治疗阿尔兹海默症；(3)聚G段寡糖是掌状海带的免疫激发子，能促进海带幼苗生长、提高海带抗病力，预防海带疾病。近年来，褐藻胶寡糖成为一种新的潜在的功能产品不断受到人们的关注，其高值化研究已经成为新的热点。褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶(PolysaceharideLyase,PL)，通过β消去反应催化褐藻胶分子内相邻糖单元之间1,4-O-糖苷键的断裂，并在寡糖产物中新产生的非还原端的糖单元的C4和C5位形成不饱和双键。为区别于饱和的糖单元M和G，通常将这一不饱和的糖单元称为Δ。这使得：(1)寡糖产物在235nm附近具有特征吸收；(2)不饱和糖单元的存在增加了寡糖产物的脂溶性。相比化学法(酸、碱、氧化)降解或者物理法(微波、超声)降解，褐藻胶寡糖的酶法降解，具有反应条件温和、产物结构稳定而明确、环境污染小等优点。褐藻胶裂解酶主要来源于海洋藻类、海洋软体动物、棘皮动物和多种微生物(包括海洋细菌、陆生真菌和极少数的病毒)，其中细菌来源的褐藻胶裂解酶研究最为广泛。褐藻胶裂解酶不仅具有重要的理论研究价值，还可用于制备系列不饱和褐藻胶寡糖、生产生物乙醇及解析海藻多糖结构等，因而是高效的工具酶资源。根据酶对底物的选择性，通常可将褐藻胶裂解酶分为M专一性、G专一性、以及M/G兼性等三大类；根据酶的底物降解模式，又可以分为内切酶、外切酶等两种基本类型。铜绿假单胞菌是常见的机会致病菌，其粘性菌在宿主肺部产生褐藻多糖，这些褐藻多糖在囊性纤维化(CF)患者肺部形成生物膜，具有一定黏性和致密性，导致患者呼吸困难，并导致对抗生素的耐药性。褐藻胶裂解酶可分解这种菌体生物膜中的褐藻胶成分，从而恢复病原菌对抗生素的敏感性。铜绿假单胞菌和棕色固氮菌均能合成并分泌含乙酰化甘露糖醛酸的褐藻胶，且乙酰化的褐藻胶是铜绿假单胞菌的重要致病因子。在已有报道中能以乙酰化褐藻胶为底物的裂解酶较少(LXiaoetal.,2006)，有望用于囊性纤维化疾病的辅助治疗。铜绿假单胞菌来源的褐藻胶裂解酶Pae-AlgL(GenBank收录号U27829)和棕色固氮菌来源的褐藻胶裂解酶Avi-AlgL(GenBank收录号AF027499)是较早发现的细菌来源的M专一性的褐藻胶裂解酶，被人们广泛关注。已有研究主要集中在该酶参与褐藻胶生物合成过程中的功能(AoifeBoydetal.,1994，StevenR.Mondayetal.,1993,WThiangyianetal.,1999)，即在褐藻胶分泌至胞外时酶在周质空间起到“剪刀”作用，从而调节多糖的聚合度大小。而关于酶生化性质的研究较少，关于酶的底物降解模式、寡糖产物的生成模式及结构特征等，更是未见详细报道，因而无法为酶的商品化应用提供详细的参数和背景信息。此外，在铜绿假单胞菌和棕色固氮菌中，天然褐藻胶裂解酶的表达，受褐藻胶生物合成基因簇上游基因的调节(Boyetal.,1994，StevenR.Mondayetal.,1993)，产量较低，无法直接进行酶的商业化生产。早期在大肠杆菌中进行的转基因表达虽然提高了褐藻胶裂解酶的产量(RichardAetal.,1998，NealL.Schiller,etal.,1993，HelgaErtesvagetal.,1998)，但受限于表达载体和密码子偏好性等因素的影响，产量仍不能满足商业化酶的需求。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供褐藻胶裂解酶在制备系列寡糖产物中的应用。本专利技术技术方案如下：M-专一性的重组褐藻胶裂解酶在降解底物生成系列寡糖产物中的应用，所述底物为由β-D-1,4-甘露糖醛酸(M)和α-L-1,4-古罗糖醛酸(G)混合组成的褐藻胶多糖、由β-D-1,4-甘露糖醛酸和α-L-1,4-古罗糖醛酸混合组成的不饱和五糖及以上的不饱和多糖、聚β-D-1,4-甘露糖醛酸段饱和三糖及以上的饱和多糖；所述M-专一性的重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，或者，所述M-专一性的重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。根据本专利技术优选的，所述底物为由M和G混合组成的褐藻胶多糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物为不饱和二糖、不饱和三糖、不饱和四糖、不饱和五糖、不饱和六糖和不饱和七糖，摩尔比为169：28：10：7：3：1。根据本专利技术优选的，所述底物为由M和G混合组成的褐藻胶多糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和二糖为ΔM非还原性末端的二糖单元，不饱和五糖为ΔG非还原性末端的五糖单元，不饱和六糖为ΔG非还原性末端的六糖单元，不饱和七糖为ΔG非还原性末端的七糖单元。根据本专利技术优选的，所述底物为由M和G混合组成的褐藻胶多糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和三糖为含有ΔM、ΔG两种非还原性末端的三糖单元，ΔM非还原性末端的三糖单元与ΔG非还原性末端的三糖单元的摩尔比为100：104。根据本专利技术优选的，所述底物为由M和G混合组成的褐藻胶多糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和四糖为含有ΔM、ΔG两种非还原性末端的四糖单元，ΔM非还原性末端的四糖单元与ΔG非还原性末端的四糖单元的摩尔比为100：196。根据本专利技术优选的，所述底物为由M和G混合组成的不饱和五糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物为等摩尔量的不饱和二糖与不本文档来自技高网...

【技术保护点】
两种甘露糖醛酸专一性的重组褐藻胶裂解酶在降解底物生成系列寡糖产物中的应用，所述底物为由β‑D‑1,4‑甘露糖醛酸(M)和α‑L‑1,4‑古罗糖醛酸(G)混合组成的褐藻胶多糖、由β‑D‑1,4‑甘露糖醛酸和α‑L‑1,4‑古罗糖醛酸混合组成的不饱和五糖及以上的不饱和多糖、聚β‑D‑1,4‑甘露糖醛酸段饱和三糖及以上的饱和多糖；所述M‑专一性的重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Pae‑rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者，所述M‑专一性的重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Avi‑rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.两种甘露糖醛酸专一性的重组褐藻胶裂解酶在降解底物生成系列寡糖产物中的应用，所述底物为由β-D-1,4-甘露糖醛酸(M)和α-L-1,4-古罗糖醛酸(G)混合组成的褐藻胶多糖、由β-D-1,4-甘露糖醛酸和α-L-1,4-古罗糖醛酸混合组成的不饱和五糖及以上的不饱和多糖、聚β-D-1,4-甘露糖醛酸段饱和三糖及以上的饱和多糖；所述M-专一性的重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，或者，所述M-专一性的重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为由M和G混合组成的商品化褐藻胶时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和二糖、不饱和三糖、不饱和四糖、不饱和五糖、不饱和六糖和不饱和七糖，摩尔比为169：28：10：7：3：1。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为由M和G混合组成的商品化褐藻胶时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和二糖为ΔM非还原性末端的二糖单元，不饱和五糖为ΔG非还原性末端的五糖单元，不饱和六糖为ΔG非还原性末端的六糖单元，不饱和七糖为ΔG非还原性末端的七糖单元；优选的，所述底物为由M和G混合组成的商品化褐藻胶时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和三糖为含有ΔM、ΔG两种非还原性末端的三糖单元，ΔM非还原性末端的三糖单元与ΔG非还原性末端的三糖单元的摩尔比为100：104；优选的，不饱和四糖为含有ΔM、ΔG两种非还原性末端的四糖单元，ΔM非还原性末端的四糖单元与ΔG非还原性末端的四糖单元的摩尔比为100：196。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为由M和G混合组成的商品化不饱和五糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物为等摩尔量的不饱和二糖与不饱和三糖。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为聚M段饱和三糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物为不饱和二糖和单糖；所述底物为聚M段饱和四糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEA...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩文君，程媛媛，王丹丹，李俊鸽，王延辉，李福川，李新，卫洁，
申请(专利权)人：济南悟通生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37