向非人脊椎动物导入编码非人脊椎动物肽激素或细胞因子的裸DNA或RNA制造技术

本发明专利技术涉及编码非人脊椎动物肽激素或细胞因子的裸ＤＮＡ或ＲＮＡ分子向非人脊椎动物导入，以实现非人脊椎动物肽激素或细胞因子的递送的方法。本发明专利技术由此提供了另一种直接施用目的多肽的方法。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
对在人类(GH缺陷者)和动物(主要为肉用动物种类)上外源应用GH的结果的描述与其合成代谢潜能是一致的。因此正常GH水平的提高导致骨生长和质量的提高，瘦肉量的提高，以及脂肪组织的降低。在PNU已研究了给予重组猪生长激素(pST)或GHRH对猪的性能的效果，并已在文献中报导。如果将足够的GH连续给予生长期动物(例如，按天注射)，那么最终结果是瘦体重增加速率和效率的提高。如果将足够的外源GH连续给予哺乳期奶牛(例如按天注射)，其产乳效果明显表现为牛奶产量的提高。在引用的所有例子中，都需要在持续时期内给予大量GH以便看到合成代谢或产乳效果。其一方面的原因是大量外源GH会导致GH级联(促生长素抑制素和IGF1)的负效应，从而减少垂体前叶产生的内源GH。因此，所给外源GH必须不仅足够取代由垂体前叶产生的常规GH日量，还要使GH水平高于动物中正常情况下存在的GH。除了其合成代谢效应，文献中还报导过GH对免疫系统有积极效果。在淋巴细胞和网状内皮系统的细胞中已鉴定到了GH和IGF受体。体外研究表明用GH和IGF-1进行刺激后，都能提升淋巴细胞的增殖。已证明GH是胸腺细胞成为成熟T淋巴细胞的关键因素，并能使动物在用脂多糖处理后免于内毒素休克。基因免疫接种是直接将细菌质粒接种到哺乳动物宿主的组织中。当这些细菌质粒含有真核表达盒时，会表达基因产物，并产生几种生物效应之一。如果所编码的基因产物对于宿主是异源的，表达带来的一个后果是诱导免疫应答。基因免疫接种已成功地用于诱导抗体以及针对多种潜在病原微生物的基因产物的细胞毒性T淋巴细胞应答。表达产物的其他生物学后果取决于基因产物是否为激素的一个酶。那样的话，表达产物会作用于宿主中存在的其正常生理目标。少有对利用基因免疫接种来递送生物活性分子的报导，但已描述过编码激肽释放酶的cDNA对血管高血压的缓解作用。虽然经基因免疫接种施用的质粒DNA在宿主中保持时间长，但并未显示出能在体内表达显著量的所编码的基因产物。因此，在一个象GH级联这样的生物系统中，当由于外源供应(例如GH)而导致介导物水平提高时，造成生理产量下降，基因免疫接种也许不能产生足够的蛋白质来代替内源水平并使其水平高于正常生理标准。在过去几年内，全世界已有许多研究人员相当成功地利用裸DNA(含有编码目的蛋白质的真核表达盒的细菌质粒)来免疫动物。优选的递送技术是肌内注射DNA溶液，或将金颗粒包裹DNA的轰击递送至动物的真皮内。我们已初步成功地用编码病毒糖蛋白、细胞因子或牛生长激素(bST)的裸DNA免疫接种了鼠或猪。但是，几乎没有国外研究人员或者我们自己也不能最终证明，通过这一机制递送的细胞因子或生长激素能在宿主内达到足够高的血清水平，从而诱导适当的生物应答(例如由于外源生长激素造成的性能增强)。今年早先在猪中注射编码bST的质粒的实验表明，产生了足够的牛生长激素从而在约50％的免疫动物之血清中诱导出高滴度抗bST抗体。由于外源给予该蛋白质造成内源生长激素血清水平的少量提高，用足量粗蛋白质喂养的猪生长率提高，我们决定利用一种已充分表征并且灵敏的生长筛选模型来确定肌内(i.m.)注射裸质粒pST-DNA是否能提高猪的平均日增重(ADG)和饲料利用率(FE)。直接用编码真核表达盒的细茵质粒接种动物已被证明是一种能产生针对多种蛋白质抗原(Rev1)的免疫应答的有效方法。通过简单的盐溶液注射或通过粒子轰击递送DNA沉积其上的小惰性(金)珠，就可以用纯化过的质粒DNA接种组织。任何一种类型的递送之后，接种位点周围的主要细胞型通常都被转染，并表达真核表达盒所编码的基因产物。在注射针递送的情况下，接种的一般途径是肌内，肌细胞是主要的转染细胞。转染的方法有争议，但似乎肌细胞能从胞外环境中活跃地摄取注射的DNA(2-4)。相反，粒子轰击递送能将DNA导靶到表皮，主要的细胞型是角质细胞(5)。粒子轰击递送比针头递送更加有效，只要1/1000倍至1/100倍的DNA，主要是因为DNA被直接注入角质细胞的胞浆(6，7)。这两种DNA免疫接种方法的另一显著差别反映了转染的原代细胞型的体内半寿期。接种到肌肉组织的质粒DNA仍是可测的，并在1年甚至更长时间内保持转录活性(8，9)。而粒子轰击递送的DNA多数在接种几周内由于宿主表皮层的自然脱落过程而丢失。对于DNA免疫接种应用的多数描述集中在其诱导针对所编码蛋白质的抗体(Ab)和细胞毒性T淋巴细胞(Tc)的能力上(Rev1)。有趣的是这些免疫反应的诱导基本上不依赖于接种位点周围的转染细胞，而是主要取决于来源于宿主骨髓的体细胞。这暗示负责诱导免疫反应的转染细胞是位于接种位点的转染了的抗原递呈细胞(apc)(10)。更可能或更起作用的效果是某些DNA被导向从接种位点流出的淋巴组织，并转染那里的长寿命、有效的apc(比如树突细胞)。很少有研究人员描述过DNA免疫接种作为调节蛋白质(比如激素和细胞因子)的持续递送载体的用途。文献中少有成功的报导涉及在大鼠中脱辅基脂蛋白A的血清水平上升(11)，通过将编码鼠白细胞介素10的质粒接种至感染小鼠角膜来下调疱疹性基质角膜炎(12)，以及表达激肽释放酶基因作为心血管和肾脏疾病中高血压的疗法(13)。考虑到我们利用DNA免疫接种成功地给猪和啮齿动物接种疫苗的初步成功，我们决定研究将这项技术作为牛生长激素的递送方法。优选加入本专利技术所述组合物的蛋白质或肽是胰岛素和胰岛素样生长因子、干扰素、生长激素释放因子、白细胞介素等。最优选的是生长激素或促生长素，尤其是牛和猪的促生长素，以及生长激素释放因子。所述蛋白质或肽可以得自天然组织(“天然的”)或者通过重组技术产生(“重组的”)，并且包括具有修饰或改变的氨基酸序列的蛋白质或肽。关键特征是蛋白质或肽能在其给药的物种中保持生物活性。专利技术概述本专利技术提供了一种将编码非人脊椎动物肽激素或细胞因子的裸DNA或RNA分子导入非人脊椎动物，以完成所述非人脊椎动物肽激素或细胞因子的递送的方法。在一个实施方案中，本专利技术涉及一种将所需生理活性蛋白质、多肽或肽生长激素或细胞因子递送至非人脊椎动物的方法，包括将与启动子可操纵地连接在一起的非感染性、非免疫原性、非整合性DNA序列注射到所述脊椎动物肌肉内，其中所述DNA序列编码生长激素或细胞因子，其中DNA序列不与协助转染蛋白质、病毒颗粒、脂质体制剂、带电荷脂类和磷酸钙沉淀剂结合，籍此所述DNA序列得以表达。在一个优选实施方案中，所述脊椎动物是哺乳动物。在另一个优选实施方案中，所述生长激素或细胞因子选自猪生长激素、牛生长激素、犬生长激素、牛IGF-1、猪IGF-1、犬IGF-1、牛生长激素释放因子、猪生长激素释放因子以及犬生长激素释放因子。在一个更优选的实施方案中，所述生长激素或细胞因子具有与所述脊椎动物的天然生长激素或细胞因子相同的氨基酸序列。专利技术详述本专利技术涉及将编码非人脊椎动物肽激素或细胞因子的裸DNA或RNA分子导入非人脊椎动物，从而递送所述非人脊椎动物肽激素或细胞因子。在一个实施方案中，本专利技术涉及一种将所需生理活性蛋白质、多肽或肽生长激素或者细胞因子递送至非人脊椎动物的方法，包括将与启动子可操纵地连接在一起的非感染性、非免疫原性、非整合性DNA序列注射到所述脊椎动物肌肉内，其中所述编码本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种向非人脊椎动物递送所需的生理活性蛋白质、多肽或肽生长激素或者细胞因子的方法，包括将与启动子可操纵地连接在一起的非感染性、非免疫原性、非整合性ＤＮＡ序列注射到所述脊椎动物肌肉内，其中所述ＤＮＡ序列编码生长激素或细胞因子，其中所述ＤＮＡ序列不与协助转染的蛋白质、病毒颗粒、脂质体制剂、带电荷脂类和磷酸钙沉淀剂结合，籍此使所述ＤＮＡ序列表达。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：S马丁，PF罗素，
申请(专利权)人：法玛西雅厄普约翰美国公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]