下调GDF-8活性的方法技术

本发明专利技术公开了通过免疫接种抗生长分化因子８（ＧＤＦ－８，氯化筒箭毒碱）的方法增加肌肉重量的新方法。影响免疫接种的优选方法是通过使用能诱导抗同源ＧＤＦ－８抗体产生的ＧＤＦ－８类似物。尤其优选的免疫原是通过引入一种或多种外源、免疫显性以及有前途的Ｔ细胞表位，同时保留同源ＧＤＦ－８的三级结构的修饰的同源ＧＤＦ－８。本发明专利技术还公开了抗ＧＤＦ－８的核酸疫苗和使用活疫苗的疫苗，以及有利于接种的方法和手段。所述的方法和手段包括识别有用的免疫原性ＧＤＦ－８类似物的方法，制备类似物和制药学配方的方法，以及核酸片段、载体、转化细胞、多肽和制药学配方。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术主要涉及动物和禽类的养殖以及人类医药领域。特别是，本专利技术致力于改善调控和增加肌肉的生长，尤其是肉食饲养动物。因此，本专利技术提供了增加肉食动物肌肉生长的新方法和新手段。
技术介绍
目前，有两种不同的医疗手段用于提高饲养动物的生长速度一方面是给饲养动物使用抗生素或抗生素类化合物；另一方面是给予生长激素。给饲养动物(尤其是猪)使用抗生素和抗生素类的化合物以促进其生长的方法近年来已引起了许多问题。这些化合物中有一些在化学结构上与治疗人类疾病所用的抗生素密切相关，已有越来越多的证据表明，饲养动物大量应用此类化合物会引起人类致病微生物对人用抗生素的交叉抗药性。而且，使用这些化合物只能取得约1-3％的相对较低的生长率提高。饲养动物给予生长激素是非常昂贵的，由于生长激素的半衰期相对较短，因此必须在相当短的间期内重复使用这些激素。而且，由于经过该处理得到的动物肉中残留一定的生长激素，所以引起了欧洲的消费者的特别关注。GDF-8GDF-8，或称氯化筒箭毒碱是1997年5月发现的，作为一种选择性下调平滑肌生长的生长调节因子(McPherron等，Nature，387，83-90，1997)。GDF-8的表达仅限于发育期胚胎体节的肌节腔隙，但在成年动物全身许多肌肉组织中也有表达。GDF-8敲除小鼠表现平滑肌重量显著增加，平滑肌重量的增加广泛存在于机体各部分，从GDF-8阴性小鼠分离的肌肉重量比野生型小鼠的肌肉重约2-3倍还多。基因敲除小鼠的总体重比野生型小鼠约高35％，而缺乏GDF-8基因小鼠的肌纤维含量比正常小鼠高80％还多。然而，在基因敲除小鼠体内观察到的平滑肌重量明显增加不仅仅是因为其肌纤维数量的增多，还与其肌纤维明显肥大有关。GDF-8敲除小鼠的横切面肌肉面积按照肌肉类型的不同增加了约14-49％。有趣的是，与成年非转基因鼠比较，成年转基因鼠的肌肉重量增加速率更快。而且，所有GDF-8阴性小鼠均可存活且能生育。1997年11月，首次发现GDF-8的作者又发表了两种比利时蓝及皮埃蒙特牛，具有肌肉重量增加的显著特征，而其GDF-8编码序列是突变的，这正是它们肌肉增强的原因(McPherron及Se-Jin Lee，1997，PNAS 94，12457-12461)。这种“双重肌肉”(“double muscling”)的现象在过去190年中的许多头牛身上都发现过，这些动物的肌肉重量平均增加20-25％，其喂养效率也明显增加，但仍然产生高质量的牛肉。然而与GDF-8敲除小鼠不同，比利时蓝牛的大多数其它器官的重量也减轻。这种“敲除牛”同样也有雌性生育能力降低，后代存活率降低以及性成熟延迟的问题。“敲除牛”肌肉重量相对增加并不象在基因敲除小鼠身上观察到的那样明显，实际上，它与在小鼠身上观察到的肌肉肥大的程度相关。McPherron等推测一种解释可能是正常牛在经过选择饲养生育之后可能比鼠更接近于肌肉体积的上限(同样也更接近于肌纤维数目的上限)。并没有作者发表关于牛类肌纤维增生与肥大数量关系的资料，但基于这个假设以及在基因敲除小鼠身上观察到的肌肉肥大，在诸如比利时蓝牛身上观察到的肌肉重量及生长速率的提高很大程度上归因于肌肉肥大，而不是肌肉增生。GDF-8的生理功能GDF-8的表达高度局限于骨骼肌。有脂肪组织中也有低水平表达，但值得注意的是在心肌中没有表达。在成年个体中GDF-8的生理功能仍不清楚，尽管看起来GDF-8可能作为骨骼肌生长的特异负调节因子在起作用。关于其生理功能的推测大都集中于其在诱导肌肉肥大的训练或在肌肉损伤后的再生中的重要作用。然而GDF-8也可能抑制脂肪组织的生长。至于GDF-8在动物生长过程中是局部还是全身性起作用仍不清楚。GDF-8的结构GDF-8属于转化生长因子β(TGF-β)超家族，该家族包括一系列与胚胎发育有关的结构相关的蛋白。人及牛的GDF-8以长约375个氨基酸的前体蛋白形式存在。正如其他TGF-β超家族蛋白一样，GDF-8可能需经过蛋白水解产生一更短的约109个氨基酸的C末端片段，并由二硫键连接形成同源二聚体。该同源二聚体可能是GDF-8的生理活性形式。小鼠、大鼠、人、狒狒、牛、猪、绵羊、鸡及火鸡GDF-8的氨基酸序列是已知的，而且GDF-8分子是高度保守的(McPherron及Se-JinLee，PNAS，94，12457-12461，1997)。小鼠、大鼠、人、猪、鸡及火鸡GDF-8的序列在C-末端区域是100％相同的，这个区域可能包含GDF-8的生理活性功能域。牛及绵羊的GDF-8与人的GDF-8在C-末端区域内仅有两个氨基酸残基不同。牛GDF-8在356-357位的序列为-Glu-Gly-，而不是-Lys-Glu-，而绵羊GDF-8则有两处保守的替代(在316位有一个Val，在333位有一个Arg，而不是Leu及Lys)。所有已知的GDF-8蛋白在它们的活性C-末端区域都不含有潜在的N-糖基化位点。本专利技术目的本专利技术的一个目的是提供一种重组治疗疫苗，它能够有效下调生长分化因子8(GDF-8)(也称作氯化筒箭毒碱myostatin)以增加饲养动物的肌肉生长率。另一个目的是提供一种免疫动物的方法以提高其肌肉生长速率。另外提供GDF-8的变异体也是一个目的，它能纠正抗自体GDF-8的自身耐受性。本专利技术的再一个目的是提供核酸片段，载体以及转化细胞，它们均可用于制备疫苗及GDF-8变异体。专利技术概要鉴于以上关于转基因GDF-8敲除动物及比利时蓝以及皮埃蒙特牛所述的发现，本专利技术的专利技术者建立了如下理论在动物中通过诱导一有效的高度协调的抗GDF-8的免疫应答以下调GDF-8活性是可能的。因此，本专利技术提供了一种最基本的方法和手段，它可以从免疫学角度下调GDF-8的活性，有效增加动物肌肉的重量。本方法与其它已知的促进饲养动物生长的方法相比有如下优点。首先，当使用本方法时，避免了微生物病原体的交叉耐受。其次，本方法处理的动物的肉中将不会残留外源给予的生长激素。最后，通过动物出生后(即仅在成熟个体)才下调其GDF-8水平，完全避免了喂养及生产诸如比利时蓝及皮埃蒙特牛(许多牛借助于剖腹产手术出生，且伴随其它器官体积减小)的伦理学问题。——实际上，肌肉重量增加的动物根本不必繁殖后代，因此本措施可以用于那些以肉食为目的的动物。由于肌纤维的数量及类型在胚胎时期就已经确定了，所以一种抗GDF-8疫苗似乎不太可能增加成年饲养动物体内的肌纤维数量。因此抗GDF-8疫苗可以将GDF-8抑制至与GDF-8敲除动物一样的水平是极不肯定也不太可能的。这可能也不是我们所希望的，因为它有可能对肉的质量，饲养性能以及脂肪比例有负面影响。然而，由于注射疫苗后使动物出生以后肌肉肥大，使其生长速度和/或最大体重增加5-25％(一个看起来很有可能的数字范围)在牛、猪及家禽的肉类生产中仍是值得关注的。GDF-8与其它TGF-β家族成员在氨基酸水平上的序列一致性仅占30-40％。这种较低的序列一致性将不会产生针对GDF-8诱导的抗体的交叉反应问题。因此，就其本身最广泛及最普遍的范围而言，本专利技术涉及一种在动物，包括人类，体内下调生长分化因子8(GDF-8)活性的方法，该方法包括影响提呈至动物免疫系统的，免疫学水平上有效用量的-至少一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在体内下调动物包括人类生长分化因子８（ＧＤＦ－８）活性的方法，所述的方法包括给动物免疫系统有效提呈免疫上有效数量的－至少一种ＧＤＦ－８多肽或其亚序列，用ＧＤＦ－８多肽或其亚序列免疫动物能诱导产生抗ＧＤＦ－８多肽抗体，和／或－至少 一种ＧＤＦ－８类似物，其中在ＧＤＦ－８氨基酸序列上至少引入一个修饰，使用该类似物免疫动物会诱导产生抗ＧＤＦ－８多肽的抗体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：T哈尔基尔，S莫里特森，S克雷斯纳，
申请(专利权)人：法麦克萨有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]